離子排斥色譜法同時測定生物質(zhì)液體燃料發(fā)酵液中的有機酸、糖、醇*

楊海燕，法蕓

(中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，生物基材料重點實驗室，山東青島 266101 )

生物質(zhì)能源具有存量豐富、環(huán)境友好、可再生等特點，作為能轉(zhuǎn)化為液體燃料的可再生資源，正日益受到重視。利用富含木質(zhì)纖維素的作物秸稈制備液體燃料的研究已經(jīng)成為新的關(guān)注熱點［1–5］。木質(zhì)纖維素經(jīng)過預(yù)處理后先轉(zhuǎn)化為糖再進行發(fā)酵可生產(chǎn)乙醇，該體系成分復(fù)雜，而檢測發(fā)酵體系中的混合糖及其代謝產(chǎn)物——有機酸及醇等，對考察木質(zhì)纖維素水解液的利用情況、產(chǎn)醇效率及菌株代謝過程具有重要意義。

1991年Doyon［6］等首次報道了使用離子排斥色譜法結(jié)合示差和二極管陣列檢測器同時分析食品中的有機酸，糖類和乙醇。離子排斥色譜法檢測食品、環(huán)境樣品中的糖、有機酸已有很多報道［7–12］。姜岷［13］、馬瑞［14］等先后運用離子排斥色譜法分別檢測了厭氧產(chǎn)丁二酸發(fā)酵液和米根霉乳酸發(fā)酵液中的有機酸和糖。袁文杰［15］等用相同方法同時分析了菊芋發(fā)酵液中的乙醇和有機酸。但國內(nèi)用于生物能源領(lǐng)域液體燃料乙醇研究中的報道較少，分析發(fā)酵液體系的上述報道，均在小于55℃的柱溫條件下進行，對于成分復(fù)雜的發(fā)酵液體系，仍存在組分共淋洗的干擾。

筆者采用離子排斥色譜柱Bio-Rad Aminex HPX–87H和示差折光檢測器，在65℃的條件下實現(xiàn)了單糖、二糖、有機酸和醇的有效分離。建立了同時檢測秸稈發(fā)酵液中的纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸及乙醇8種有機物的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent1200型，配RID檢測器、Agilent色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司；

離心機：Sigma1–14型，最大轉(zhuǎn)速14 800 r／min，德國Sigma公司；

電子天平：EL204–IC型，瑞士梅特勒–托利多公司；

超純水機：Milli-Q Reference型，美國Millipore公司；

硫酸：分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸、乙醇：糖為25 g／瓶、酸為10 mL／支，優(yōu)級純，美國Sigma公司。

1.2 色譜條件

離子排斥色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX–87H型（300 mm×7.8 mm，9 μm）；保 護 柱：Cation-H Refill Cartridges型（30 mm ×4.6 mm）；流動相：5 mmol／L H2SO4溶液；流量：0.6 mL／min；柱溫：65 ℃；檢測器：RID；進樣體積：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用超純水分別配制8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲備溶液，然后按比例稀釋成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（具體濃度見表1）。按1.2色譜條件進樣分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度 mg／L

1.4 樣品處理

取5 mL玉米秸稈發(fā)酵液，以6 000 r／min離心5 min，除去難溶性物質(zhì)，取上層清液稀釋10倍，然后用0.22 μm濾膜過濾即得待測液。

2 結(jié)果與討論

2.1 柱溫的選擇

文 獻(xiàn)［10，11，15］使 用Bio-Rad Aminex HPX–87H柱分析有機酸及糖、醇時所用柱溫各不相同，為確認(rèn)柱溫對分析效果的影響，在色譜柱的耐溫范圍內(nèi)考察了柱溫45～65℃時的分離情況，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出柱溫對葡萄糖和木糖、丁酸和乙醇的分離度都有影響，尤其是對丁酸和乙醇的分離度影響較大。60℃以下丁酸與乙醇的色譜峰重合，60℃時可以將兩者分開，在65℃的條件下，丁酸與乙醇的分離效果最好，色譜峰形尖銳。因此選擇最佳柱溫條件為65℃。

圖1 柱溫對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分保留時間的影響

2.2 線性方程和檢出限

在1.2色譜條件下對按照表1所配制的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測試，以色譜峰面積對溶液的質(zhì)量濃度進行線性回歸，得各被測物質(zhì)的回歸方程，以信噪比S／N=3計算檢出限。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。由表2可知，8種標(biāo)準(zhǔn)品線性相關(guān)系數(shù)(r2)在0.999 0～0.999 99之間。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限

2.3 精密度和加標(biāo)回收試驗

取發(fā)酵液樣品與表1中4#標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合均勻，然后用0.22 μm濾膜過濾，按1.2色譜條件進樣分析，重復(fù)6次，測定結(jié)果見表3。由表3可知，加標(biāo)樣品6次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%～2.19%，平均回收率為97.47%～107.41%。加標(biāo)樣品色譜圖如圖2，圖中可見8種組分之間及其與樣品基質(zhì)之間分離良好。

表3 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

圖2 玉米秸稈發(fā)酵液樣品和加標(biāo)后發(fā)酵液樣品的色譜圖

2.4 樣品分析

將秸稈發(fā)酵液樣品按照1.4方法進行處理后測定，樣品中各代謝組分均得到了基線分離，色譜峰形尖銳。各組分測定結(jié)果見表4。

表4 秸稈發(fā)酵液樣品測定結(jié)果

3 結(jié)語

采用離子排斥色譜法實現(xiàn)了生物質(zhì)發(fā)酵液中纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸及乙醇8種有機物的同時分析。該方法簡單快速、準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于生物能源領(lǐng)域液體燃料乙醇的研究，適用于秸稈發(fā)酵液中多種糖類、有機酸、醇等化合物的分析。

［1］馬晶，張鑒達(dá)，申哲民.秸稈生產(chǎn)燃料乙醇的研究進展［J］.環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警，2010，2(3): 45–49.

［2］路鵬，江滔，李國學(xué).木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵研究中的關(guān)鍵點及解決方案［J］.農(nóng)業(yè)工程報，2006，22(9): 237–240.

［3］杜金峰，張萬忠，王云山，等.不同預(yù)處理方法對玉米秸稈酶解和乙醇發(fā)酵的影響［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42(2): 195–199.

［4］錢名宇，張晶，劉繼開，等.木質(zhì)纖維素稀酸水解液乙醇發(fā)酵的新方法［J］.太陽能學(xué)報，2006，27(6): 618–622.

［5］黃茜，黃鳳洪，江木蘭，等.木質(zhì)素降解菌的篩選及混合菌發(fā)酵降解秸稈的研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28(2): 66–70.

［6］Doyon G，Gaudreau G，ST–Gelais. Simultaneous HPLC Determination of Organic Acids，Sugars and Alcohols［J］.Canadian Institute of Food Science and Technology Journal，1991，24: 87–94.

［7］劉宇鵬，鄭璞，孫志浩.采用離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12): 119–123.

［8］付永前，高振，李霜，等.離子排斥色譜法分析米根霉富馬酸發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(1): 131–134.

［9］潘廣文，趙增運，胡忠陽，等.高效離子排斥色譜法測定蔬菜中的馬來酰肼［J］.色譜，2010，28(7): 712–715.

［10］王平，周榮.高效液相色譜法測定植物根系分泌物中的有機酸［J］.色譜，2006，24(3): 239–242.

［11］Chinnici F，Spinabelli U，Amati A. Simultaneous determination of organic acids，sugars，and alcohols in musts and wines by an improved ion-exclusion HPLC method ［J］. J Liq Chromatogr Related Technol，2002，25(16): 2 551–2 560.

［12］林曉婕，魏巍，何志剛，等.離子排斥色譜法測定黃酒中的13種有機酸［J］.色譜，2014，32(3): 304–308.

［13］姜岷，姚嘉旻，陳可泉，等.纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸發(fā)酵液中有機酸和混合單糖的測定［J］.分析化學(xué)，2009，37(4): 605–608.

［14］馬瑞，歐陽嘉，李鑫，等.高效液相色譜法同時測定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機酸及糖類化合物［J］.色譜，2012，30(1): 62–66.

［15］袁文杰，孔亮，孜力汗，等.高效液相色譜法測定克魯維酵母菊芋發(fā)酵液中的乙醇，糖和有機酸類代謝成分［J］.分析化學(xué)研究報告，2009，37(6): 850–854.