缺血性糖尿病潰瘍模型探討*

彭旦明 盧仁軍 趙詩云 張瑾楠

（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046；2江西中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生 南昌330004）

糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神經(jīng)病變及各種不同程度末梢血管病變而導(dǎo)致下肢感染、潰瘍形成或深部組織的破壞[1～2]，糖尿病嚴(yán)重的患者可能截肢，給病人帶來沉重的生理和心理負(fù)擔(dān)。近年來糖尿病足發(fā)病率明顯增加，但關(guān)于糖尿病足的發(fā)病機(jī)理仍不清楚，合適的糖尿病足模型的建立顯得十分重要。缺血-再灌注損傷是導(dǎo)致糖尿病潰瘍發(fā)生的重要原因之一[3]，鏈脲佐菌素（STZ）的劑量對(duì)動(dòng)物血糖及維持時(shí)間影響重大，可直接影響潰瘍的形成與愈合時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察不同劑量STZ對(duì)糖尿病足大鼠模型的影響，尋求最佳劑量，建立合適的糖尿病大鼠潰瘍模型?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠（購自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK[湘]2011-0003）70 只，體重 180～200 g，SPF 級(jí)。動(dòng)物飼料由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司生產(chǎn)，許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫 20～25℃，濕度40%～70%，單籠喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 鏈脲佐菌素（上海源聚生物科技有限公司）；檸檬酸，檸檬酸三鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；戊巴比妥鈉（西亞試劑有限公司）；碘伏消毒液，95%乙醇消毒液（江西草珊瑚消毒用品有限公司）。

1.3 儀器 羅氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀，血糖測(cè)試紙（德國Roche公司產(chǎn)品）；超凈工作臺(tái)（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；Olympus光學(xué)顯微鏡（上海天放實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；磁通量1 500高斯圓片形磁鐵（直徑13 mm、厚度2 mm，由深圳明鑫科技有限公司提供，所有磁鐵使用前均高壓滅菌消毒）。

1.4 糖尿病大鼠潰瘍模型制備 將SD雄性大鼠70只隨機(jī)分為7組，每組10只，空白對(duì)照組及6個(gè)劑量 STZ 組 ， 劑 量分 別為 30、40、45、50、55、60 mg/kg，背部剃毛消毒。以3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量腹腔注射，麻醉后在大鼠背部脊柱一側(cè)做一深至筋膜的切口，鈍性分離，將磁片植入皮下，切口縫合后消毒，手術(shù)后的大鼠單籠飼養(yǎng)。4 d后創(chuàng)口完全愈合，第5天禁食12 h，按照上述劑量腹腔注射1%的STZ（STZ使用前用0.1 mol/L、pH=4.5的檸檬酸緩沖液調(diào)配），分別在注射STZ前及注射1 d、3 d、7 d、10 d、14 d 測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖值、體重、飲水量及進(jìn)食量。注射STZ第10天（大鼠糖尿病成模），在埋植磁鐵處接外源磁片，外接磁鐵與體內(nèi)植入的磁鐵相互吸引產(chǎn)生壓力，造成局部皮膚缺血，每次磁鐵壓迫時(shí)間為2 h、2 h、1 h，中間將磁鐵拿下，讓組織血流恢復(fù)30 min，如此為一個(gè)循環(huán)，每天3個(gè)循環(huán)，連續(xù)4 d。觀察大鼠潰瘍的形成與變化，第15天（壓迫結(jié)束后）取潰瘍周邊皮膚組織10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片（4 μm），HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織病理狀況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用Cochran&Cox近似t檢驗(yàn)。P＜0.05表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異，P＜0.01表示結(jié)果具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 磁片植入皮下切口縫合后，約4 d時(shí)間動(dòng)物傷口可完全愈合，對(duì)照組及30 mg/kg STZ給藥組動(dòng)物活動(dòng)、進(jìn)食量、飲水量及血糖量未見明顯異常，而40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg STZ 給藥組動(dòng)物隨著劑量的增加，動(dòng)物活動(dòng)明顯減弱，體形消瘦，毛發(fā)干枯、豎立，飲水量及尿量明顯增多，STZ劑量為60 mg/kg實(shí)驗(yàn)組大鼠體重下降過快，部分動(dòng)物出現(xiàn)死亡。在埋植磁鐵處接外源磁片后，連續(xù)4 d每天3個(gè)循環(huán)壓迫，對(duì)照組及STZ給藥組均形成了潰瘍。

2.2 皮膚組織病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組大鼠皮膚切片顯示：表皮角質(zhì)清晰，復(fù)層排列存在，毛囊結(jié)構(gòu)正常，真皮膠原豐富，表皮與真皮厚度正常。STZ給藥組大鼠表皮真皮組織復(fù)層排列消失，組織出血滲血、壞死出現(xiàn)空泡，炎性細(xì)胞大量聚集等特征。

2.3 各組大鼠血糖值的變化 結(jié)果顯示：腹腔注射STZ后，對(duì)照組及30 mg/kg STZ給藥組動(dòng)物血糖值在14 d內(nèi)未見明顯變化，各組動(dòng)物給藥1 d（24 h）后與給藥前相比也未見明顯變化，給藥3 d（72 h）后 ，50、55、60 mg/kg 劑 量 組 血 糖 值 大 于 16.7 mmol/L，其余各劑量組動(dòng)物血糖值均明顯增高，但不到16.7 mmol/L。在給藥7 d后，除了30 mg/kg組外，其余STZ給藥組動(dòng)物血糖值均大于16.7 mmol/L（血糖儀最大測(cè)定值為33.3 mmol/L，超值后按33.3 mmol/L計(jì)）。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血糖值的變化 （±S） mmol/L

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血糖值的變化 （±S） mmol/L

注：經(jīng) t檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 4.6±0.5 4.3±0.8 4.9±0.4 4.8±0.7 4.9±0.4 4.5±0.6 4.7±0.3 4.7±0.6 4.9±0.8 5.5±0.7 5.2±0.9 5.3±0.1*5.7±0.4*5.9±0.7*4.4±0.6 5.0±0.9 9.5±1.2*10.7±2.0*18.4±2.4**#19.0±2.2**#21.4±3.2**##4.7±0.6 4.3±0.7 21.6±2.3**21.3±3.2**26.9±2.1**#27.4±3.6**#30.4±1.5**##4.4±0.6 5.1±0.3 29.5±2.4**30.9±1.7**31.2±0.4**30.2±1.5**32.7±0.2**5.4±0.4 5.2±0.8 30.7±1.5**29.5±2.2**31.0±0.9**31.1±0.7*32.8±0.3**

2.4 各組大鼠體重的變化 結(jié)果表明：給藥前各組大鼠體重?zé)o明顯差異，P＞0.05。給藥后除 30 mg/kg STZ給藥組外，其余各組大鼠體重明顯下降，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異，P＜0.05。在自由攝食、進(jìn)水的狀態(tài)下，正常對(duì)照組大鼠體重隨著時(shí)間的推移體重不斷增加，而同樣在自由攝食、進(jìn)水的狀態(tài)下，糖尿病足組大鼠隨著時(shí)間的推移體重逐漸下降，其中60 mg/kg STZ給藥組大鼠體重下降幅度過快，當(dāng)體重下降幅度達(dá)到50 g左右時(shí)，出現(xiàn)死亡，10只大鼠實(shí)驗(yàn)期間死亡5只。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠體重的變化 （±S） g

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠體重的變化 （±S） g

注：經(jīng) t檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 190.3±16.8 188.2±24.7 186.9±14.0 194.5±16.6 193.1±20.8 191.9±15.3 191.2±20.9 190.5±27.9 190.1±18.9 186.2±14.1 195.1±17.5 186.7±16.2 191.3±11.6 190.3±18.7 194.7±26.7 193.0±23.8 182.9±13.4 190.3±15.9 179.7±19.6*177.9±17.5*175.3±20.5*#200.2±18.6 202.1±25.1 175.7±19.9*178.2±15.4*178.3±27.4*176.8±19.8**162.3±16.7**#205.3±13.7 210.7±26.8 171.7±11.6**176.3±10.5**171.2±21.3**165.9±10.5**155.6±14.8**##210.7±20.4 217.3±17.9 166.4±14.5**170.3±19.6**165.6±15.8**160.9±22.4**150.8±15.8**#

2.5 各組大鼠飲水量的變化 結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)初各組大鼠飲水量并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，給藥后1 d后，除30 mg/kg給藥組大鼠外，其余劑量組大鼠飲水量均明顯增多（P＜0.05），第3天后大鼠飲水量較正常組增加數(shù)倍。見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠飲水量的變化 （±S） mL

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠飲水量的變化 （±S） mL

注：經(jīng) t檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 19.3±1.9 20.2±2.6 17.8±2.3 20.2±3.6 21.4±1.8 17.9±2.1 21.7±2.3 19.6±2.5 21.1±2.9 30.6±4.5*33.3±4.4*38.1±5.9*46.1±4.6*#50.4±4.8*#20.4±2.1 20.8±2.6 82.0±7.9**79.6±10.1**107.7±9.4**#112.5±11.4**#120.6±14.4**#20.8±2.8 21.3±3.5 122.6±19.4**127.5±18.1**113.8±15.7**132.7±15.1**140.6±15.1**#18.8±2.2 22.8±3.5 155.4±10.8**158.5±12.8**155.7±14.5**#163.0±13.1**#170.1±16.7**#22.4±3.2 20.4±2.4 160.5±20.2**165.3±21.7**170.5±17.8**#169.8±18.9**#174.1±20.5**#

2.6 各組大鼠進(jìn)食量的變化 結(jié)果表明：各組大鼠均自由進(jìn)食，給藥前各組進(jìn)食量無明顯差異，P＞0.05。給藥3 d后，50～60 mg/kg給藥組大鼠進(jìn)食量明顯增多；第7～14天，給藥組大鼠除30 mg/kg外，與對(duì)照組比其余劑量組大鼠進(jìn)食量明顯增多，P＜0.05。見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)食量的變化 （±S） g

表4 實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)食量的變化 （±S） g

注：經(jīng) t檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 18.3±1.9 19.9±1.3 20.0±2.1 19.6±2.7 19.7±1.6 19.3±2.1 18.4±1.9 19.9±2.6 20.4±2.2 22.1±2.6 20.3±2.6 21.8±1.8 21.3±1.8 20.1±1.7 21.2±2.5 19.9±2.1 23.2±2.5 21.2±2.7 27.8±2.7*#26.2±2.1*#27.4±2.5*#18.2±1.5 21.5±3.6 29.1±4.5*30.7±5.2*35.7±2.7**#35.7±3.6**#40.6±4.5**#20.1±3.7 22.6±1.8 37.5±2.5**35.9±5.4**36.3±3.8**37.9±2.9**39.8±5.4**18.9±2.4 20.7±2.1 40.8±5.3**42.3±4.4**39.1±3.8**40.9±5.7**41.9±4.8**

3 討論

約15%的糖尿病患者最終都會(huì)出現(xiàn)糖尿病足潰瘍，糖尿病潰瘍難以愈合，且治愈后容易復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致糖尿病患者截肢的主要原因，其致殘率很高。普遍認(rèn)為主要是大、小及微血管病變，周圍神經(jīng)受損及各種損傷所致，血糖升高、組織缺血是造成糖尿病足的重要因素[4]。

合適的糖尿病潰瘍動(dòng)物模型對(duì)糖尿病足的研究十分重要。STZ可選擇性地作用于胰島β細(xì)胞，通過釋放NO和氧自由基，使胰島β細(xì)胞遭到破壞，從而使胰島素分泌減少。STZ給藥劑量對(duì)動(dòng)物整體生命體征、血糖值及維持時(shí)間影響重大，可直接影響潰瘍形成和變化。然而文獻(xiàn)報(bào)道STZ給藥劑量從25～60 mg/kg 不等[5～6]均可引起糖尿病，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)當(dāng)STZ給藥劑量為30 mg/kg時(shí)，血糖無明顯升高，而達(dá)到60 mg/kg時(shí)，2周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)多數(shù)動(dòng)物死亡，為了建立合適的模型有必要考察STZ的最佳給藥劑量。

當(dāng)前糖尿病足動(dòng)物模型的制備主要以化學(xué)藥物誘導(dǎo)為主，配合外部干預(yù)。糖尿病足動(dòng)物模型主要有單純化學(xué)藥物造模、化學(xué)藥物結(jié)合溫度控制造模或者配合外科手術(shù)、化學(xué)藥物配合磁片循環(huán)壓迫法四種[7]。其中葛良鵬等[8]采用磁片循環(huán)壓迫的方法，很好地實(shí)現(xiàn)了缺血與復(fù)流相交替的過程，可以很好地模擬臨床潰瘍；且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有臨床糖尿病足患者的發(fā)病特點(diǎn)：“多飲、多食、多尿、體重減輕”這“三多一少”的臨床癥狀；誘導(dǎo)出的糖尿病足潰瘍模型具有組織壞死、炎性細(xì)胞大量聚集等特征，其病理改變與人十分相似，且動(dòng)物存活率高，是一種較好的糖尿病潰瘍模型。

本實(shí)驗(yàn)選擇的是磁通量為1 500高斯的磁鐵，磁通量的選擇是根據(jù)誘導(dǎo)潰瘍的流體靜力壓計(jì)算而得。有研究表明，當(dāng)外加壓力超過局部毛細(xì)血管壓力12～32 mmHg時(shí)，可誘導(dǎo)出潰瘍，外加壓力為50 mmHg左右時(shí)最合適[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射40～60 mg/kg STZ后的大鼠均可造成糖尿病模型，但是40 mg/kg、45 mg/kg在7 d后血糖值才會(huì)高于16.7 mmol/L，50～60 mg/kg 在 3 d 后血糖值可高于16.7 mmol/L，但60 mg/kg劑量對(duì)大鼠損害過大，易造成大鼠死亡，因此認(rèn)為造成糖尿病潰瘍動(dòng)物模型STZ的合適劑量為50～55 mg/kg。

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