高效液相色譜法檢測豬肉中氟喹諾酮類藥物殘留的研究

氟喹諾酮類藥物是新一代廣泛應用的抗菌素，具有抗菌廣譜的特性，高效低毒，抗菌作用力強，低廉價格。氟喹諾酮類藥物廣泛用于預防、治療畜禽疾病，少量使用有一定的促進生長作用，但使用不當或過量使用可造成動物產(chǎn)品中藥物殘留;人體攝入后可導致細菌耐藥性，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良反應。歐盟和北美國家只批準恩諾沙星為動物專用的抗菌藥，環(huán)丙沙星已禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用。我國農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布了第235號公告，對動物性食品中獸藥最高殘留限量予以規(guī)定。其中，規(guī)定達氟沙星、恩諾沙星在豬肉中的最高殘留限量為100微克/公斤。

目前，常用的測定動物性食品中氟喹諾酮類及其活性代謝物殘留量的方法主要有：酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜法等。而高效液相色譜法具有快速、靈敏、準確等特點，是目前應用最多的方法。

在本研究中，筆者應用高效液相色譜法對來自農(nóng)貿(mào)市場的100批次豬肉樣品進行四種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，旨在驗證高效液相色譜法檢測豬肉中氟喹諾酮類藥物殘留的可行性;調(diào)查市場中流通豬肉氟喹諾酮類藥物殘留的實際情況，為動物衛(wèi)生監(jiān)督部門預防和治理食品安全問題提供依據(jù)和參考。

一、材料與方法

1.儀器和設備 美國WATERS公司2695型高效液相色譜儀，配有2475熒光檢測器。

2.試劑和材料 環(huán)丙沙星（中國食品藥品檢定研究院），恩諾沙星、沙拉沙星、達氟沙星（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），色譜純乙腈（Fisher公司），色譜純甲醇（Fisher公司），水為二次蒸餾水，磷酸、氫氧化鈉、三乙胺、磷酸二氫鉀、50毫升聚乙烯離心管、0.5微米微孔濾膜。100批次豬肉樣品，分別于2014年上半年不同時期在多個市場隨機抽取。樣品編號為：PM/CL2014001～PM/CL2014100。

3.方法 ①標準品和溶液的配置。應用感量為0.00001克的電子天平精確稱量恩諾沙星（ENR）、沙拉沙星（SAR）、環(huán)丙沙星（CIP）各0.025克，達氟沙星（DAN）0.01克。用0.03摩爾/升氫氧化鈉溶液溶解稀釋定容至50毫升容量瓶中，使其濃度為：恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星約0.5毫克/毫升，達氟沙星約0.2毫克/毫升的標準儲備液，保存在2～8℃的冰箱中，有效期為3個月。應用移液器吸取25微升的標準儲備液，取乙腈稀釋定溶至10毫升的容量瓶中，使其濃度為恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星約1.25微克/毫升，達氟沙星約0.5微克/毫升的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。0.03摩爾/升的氫氧化鈉溶液：稱取1.2克氫氧化鈉加水溶解稀釋至1000毫升。磷酸鹽緩沖溶液：取磷酸二氫鉀13.6克，加水溶解稀釋至1000毫升，用5摩爾/升的氫氧化鈉溶液（取20克氫氧化鈉用水溶解定容至100毫升）調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。0.05摩爾/升的磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4毫升，用水稀釋至1000毫升，用三乙胺調(diào)pH至2.4。②樣品處理及提取。應用絞肉機將約500克豬肉樣品全部充分絞碎，量取2±0.05克肉樣至50毫升聚乙烯離心管中，同法另取空白樣品兩份，其中一份空白樣品添加氟喹諾酮類標準品。每個離心管中加磷酸鹽緩沖液10毫升，應用蝸旋混合器將樣品充分混勻，超聲波清洗器超聲5分鐘，振蕩器中速振蕩10分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一50毫升離心管中備用。重復以上提取步驟，合并2次上清液20毫升充分混勻待凈化。LC-C18（500毫克/3毫升）固相萃取柱首先用甲醇、磷酸鹽緩沖液各5毫升活化，取5毫升上清液過柱，用水3毫升淋洗，擠干。用流動相3毫升洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)0.5微米微孔濾膜過濾，裝瓶待上機。③色譜條件。色譜柱：Athena C18-WP.100A.4.6毫米×250毫米.5微米;流動相：0.05摩爾/毫升的磷酸/三乙胺溶液——乙腈（82∶18，體積比）;流速∶1毫升/分鐘;柱溫：35±5℃;進樣體積：20微升;檢測波長：激發(fā)波長280納米，發(fā)射波長450納米。

二、結(jié)果與分析

1.計算公式 X=CsVA/AsM（納克/克）式中：X-樣品中恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星殘留量（納克/克），Cs-標準工作液中恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星的濃度（納克/毫升），V-樣品稀釋倍數(shù)，A-樣品溶液中恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星的峰面積，As-兩個平行標準工作液中恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星峰面積的平均值，M-樣品的質(zhì)量（克）。

2.標準品色譜圖 由圖1可以看出各組份分離完全，峰型良好，無分叉、拖尾、前沿現(xiàn)象，說明色譜條件合適，色譜柱效能高，流動相配比合理，標準品有效未降解。

3.方法回收率 每次實驗附帶1批次空白樣品和1批次空白添加樣品（添加量已知）。其回收率（RC）公式為：RC=空白添加樣品測定值/空白添加樣品添加值×100%。本研究共進行7次實驗，空白添加氟喹諾酮類標準品濃度為：恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星為12.5納克/克，達氟沙星為5納克/克（見圖2），其回收率均在73.7%～96.6%之間，說明其樣品處理、凈化效率高，損失待測組分少。

4.樣品結(jié)果分析 從表1可以看出，100批次豬肉樣品共有11批次檢出有氟喹諾酮類藥物殘留，檢出率11%。其中PM/CL2014007被檢測出含有達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星三種藥物，PM/CL2014013、023被檢測出含有達氟沙星、恩諾沙星兩種藥物，PM/CL2014069被檢測出含有環(huán)丙沙星、恩諾沙星兩種藥物。從表2可以看出，四種氟喹諾酮類藥物檢出率最高的是恩諾沙星，達到10%，其他三種藥物檢出率在1%～3%之間。在檢出的11批次樣品中含量均未超過我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中對該類藥物最高殘留限量為100微克/公斤的限量值。

三、結(jié)論與討論

通過對100批次豬肉樣品中四種氟喹諾酮類藥物的檢測可以看出，應用高效液相色譜法檢測氟喹諾酮類藥物靈敏、準確，便于推廣;11%的高檢出率表明此類藥物在育肥豬養(yǎng)殖中應用廣泛。恩諾沙星的檢出率尤為突出，有關部門應重點監(jiān)督。四批次樣品檢測有二種以上的氟喹諾酮類藥物，說明存在濫用獸藥以及獸藥產(chǎn)品不規(guī)范等問題。11批次被檢出樣品均未超標，說明待售動物都執(zhí)行了休藥期的規(guī)定;但低含量的抗生素并不代表對使用者沒有危害。研究者通過實驗證明，亞劑量的抗生素可使細菌發(fā)生基因突變，從而產(chǎn)生多重或單重耐藥性。豬肉中若存在亞劑量的抗生素，可通過選擇壓力方式，導致細菌發(fā)生突變，從而使其獲得抵御抗生素的能力。如果人使用含有耐藥菌株的豬肉后，可能會發(fā)生耐藥菌株在體內(nèi)蓄積，如果耐藥菌株把耐藥基因通過基因交換傳播給體內(nèi)的致病細菌，將會使人體誘發(fā)嚴重疾病。所以，有關部門應指導合理使用抗生素，嚴格執(zhí)行動物使用抗生素的休藥期，不定期監(jiān)督抽檢氟喹諾酮等抗生素的殘留限量。

作者簡介 曹忠君（1979-），男，碩士，畜牧師，主要從事畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測工作。