細(xì)胞重編程的研究進(jìn)展

夏文明

細(xì)胞重編程指在特定的條件下，分化細(xì)胞被逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)到全能性狀態(tài)、形成胚胎干細(xì)胞系，或進(jìn)一步發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程。2008年，《Science》雜志評(píng)出的十大科學(xué)進(jìn)展中，細(xì)胞重編程名列第一。我國(guó)也在“十一五”期間啟動(dòng)“細(xì)胞編程和重編程的表觀遺傳機(jī)制”的重大研究計(jì)劃。

當(dāng)受精卵發(fā)育成為成熟的個(gè)體時(shí)，特定類型的細(xì)胞是沿“單行道”的形式分化。隨著發(fā)育的進(jìn)行，這些細(xì)胞會(huì)逐漸喪失可塑性，不可逆的成為某一特定類型的細(xì)胞。例如，一個(gè)皮膚細(xì)胞不會(huì)自然而然的轉(zhuǎn)變成一個(gè)肝細(xì)胞，而小腸細(xì)胞也不會(huì)發(fā)育為腦細(xì)胞。然而，利用細(xì)胞重編程技術(shù)就可使不同類型細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換成為可能。介導(dǎo)細(xì)胞重編程的方法主要有4種，分別為體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合、特定因子轉(zhuǎn)導(dǎo)及體外培養(yǎng)篩選等。目前，科學(xué)家們通過(guò)前三種方法均成功獲得了多能性干細(xì)胞系，并通過(guò)核移植技術(shù)培育出了克隆動(dòng)物;而利用體外培養(yǎng)篩選技術(shù)只在精原干細(xì)胞中獲得成功，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。細(xì)胞重編程有著非常廣泛的應(yīng)用前景，不僅在基礎(chǔ)理論研究中，而且在應(yīng)用研究中，例如家畜繁殖、動(dòng)物保護(hù)以及人口健康等領(lǐng)域都有著重要作用。值得關(guān)注的是，細(xì)胞重編程可能為避免異體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)提供理論及技術(shù)支持。

1.體細(xì)胞核移植 是指將體細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞中構(gòu)成重組胚，并在代孕母親的體內(nèi)重新形成與供體核遺傳物質(zhì)完全一致的新個(gè)體（不包括線粒體 DNA）的一門(mén)技術(shù)。早在20世紀(jì)50年代，科學(xué)家就成功將囊胚期細(xì)胞核移植到去核的豹紋蛙的卵母細(xì)胞內(nèi);1997年，多莉羊的誕生說(shuō)明末端分化細(xì)胞表觀遺傳狀態(tài)的不可逆改變對(duì)正常發(fā)育來(lái)說(shuō)并不是必須的，也就是說(shuō)雖然體細(xì)胞具有穩(wěn)定且不可逆的特性，但在胚胎的狀態(tài)下仍可被重編程，并有能力直接發(fā)育為新的個(gè)體。2002年，研究同樣證實(shí)終末分化的細(xì)胞對(duì)核多能性的無(wú)限制性，只是分化程度與效率成反比。

目前，科學(xué)家們已著手采用體細(xì)胞核移植技術(shù)保存瀕危物種及特種動(dòng)物的基因型，并擴(kuò)展到轉(zhuǎn)基因、基因敲除等多個(gè)領(lǐng)域。研究表明，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、羊、豬等多個(gè)物種上均成功獲得了克隆后代，但克隆效率極低，且大多存在一系列的綜合癥，與供體核不完全重編程有很大關(guān)系。核完全重編程的表現(xiàn)為供體核基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)的改變，并指導(dǎo)重構(gòu)胚正常發(fā)育直至足月出生。體細(xì)胞核移植技術(shù)除用于胚胎克隆外，還可用于胚胎干細(xì)胞系的建立。由于建立起的胚胎干細(xì)胞系來(lái)源于供體核，除線粒體DNA 外，遺傳背景基本與供體細(xì)胞一致，這就為今后的臨床治療提供了更為便捷的途徑。相信在不久的將來(lái)，免疫排斥等醫(yī)學(xué)難題將不再是人類疾病的克星，更多的人們將能夠獲得更加及時(shí)、有效的救治。

2.細(xì)胞融合 1976年，胸腺細(xì)胞與胚胎癌細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了可以表現(xiàn)分化多能性的體細(xì)胞;隨后，小鼠胚胎干細(xì)胞與體細(xì)胞相融合，也獲得了同樣具有多能性的干細(xì)胞，克隆胚胎在體內(nèi)外發(fā)育無(wú)顯著差別，細(xì)胞融合法成為克隆小鼠的可行方法。但細(xì)胞融合存在著重大缺陷，重編程后的多能干細(xì)胞是四倍體，且融合率很低，移植后有排斥反應(yīng)的發(fā)生。2007年，有研究報(bào)道指出采用措施可以選擇性的將融合細(xì)胞中染色體去除，且不影響融合細(xì)胞的多能性，但去除率尚不清楚，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

3.特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)重編程 2006年，體細(xì)胞重編程領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展，科學(xué)家找到了體外“直接重編程”體細(xì)胞的方法?？茖W(xué)家利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct-4、Sox2、C-myc 和Klf4）導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中，獲得了具有類似胚胎干細(xì)胞的多能性細(xì)胞—誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。研究證明，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞非常相似。隨后，科學(xué)家利用不同的體外誘導(dǎo)方法將人體皮膚細(xì)胞成功誘導(dǎo)生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。自此，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)獲得了廣泛關(guān)注。運(yùn)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)建立患者體細(xì)胞來(lái)源的患者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，大大促進(jìn)了干細(xì)胞技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的B細(xì)胞需要過(guò)表達(dá)骨髓細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa，或抑制B細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子Pax5，才能重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這說(shuō)明雖然所有細(xì)胞都具有通過(guò)重編程形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的潛力，但細(xì)胞類型及分化狀態(tài)對(duì)重編程的影響同樣很大。

4.表觀遺傳修飾與重編程 早在1939年，Waddington于《現(xiàn)代遺傳學(xué)導(dǎo)論》中首先提出了“表觀遺傳學(xué)”一詞，認(rèn)為表觀遺傳學(xué)是遺傳學(xué)領(lǐng)域中探討基因型與表型間相互關(guān)系的新的研究方向。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，科學(xué)家們做出了“表觀遺傳是沒(méi)有DNA序列變化的、可遺傳的基因表達(dá)的改變”這一系統(tǒng)論斷。目前，對(duì)表觀遺傳的研究主要著重DNA甲基化、組蛋白乙酰化、X染色體失活、基因印跡等幾個(gè)方面。通過(guò)DNA甲基化使具有相同序列的等位基因處于不同的修飾狀態(tài)，在不改變 DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因功能。在基因組中，DNA甲基化程度越高，DNA被轉(zhuǎn)錄成RNA并翻譯成蛋白質(zhì)的可能性越小。組蛋白修飾主要包括組蛋白乙?；⒘姿峄?、甲基化、泛素化及蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和染色質(zhì)重塑等幾個(gè)方面，其中組蛋白乙?；图谆揎椨葹橹匾?，且相互抑制。一般來(lái)說(shuō)，組蛋白乙?；揎検菚簳r(shí)的，能選擇性地使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，為某些基因的轉(zhuǎn)錄提供前提，增強(qiáng)其表達(dá)水平;而組蛋白甲基化修飾比較穩(wěn)固，特別是三甲基化修飾。通常認(rèn)為，組蛋白甲基化使染色質(zhì)失活，而乙酰化使染色質(zhì)活化。組蛋白已不再是簡(jiǎn)單的DNA包裝蛋白，也是基因活性動(dòng)態(tài)調(diào)控因子。X染色體失活是指雌性哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育早期的兩條X染色體之一喪失遺傳性狀表達(dá)功能，屬于與性別相關(guān)的基因調(diào)控。在哺乳動(dòng)物中，由于性別差異，雌雄個(gè)體細(xì)胞中的X染色體數(shù)目不同，為平衡不同X染色體數(shù)目細(xì)胞中X連鎖基因的表達(dá)量，生物體在進(jìn)化過(guò)程中引入了劑量補(bǔ)償機(jī)制。劑量補(bǔ)償作用是通過(guò)雌性胚胎一條X染色體的失活和異染化獲得?；蚪M印跡是表觀遺傳學(xué)上又一重要的修飾方法，來(lái)源于親本的等位基因不對(duì)稱修飾后導(dǎo)致單等位基因的表達(dá)。印跡基因在哺乳動(dòng)物配子中優(yōu)先表達(dá)，基因印記的完整性是原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞核具有全能性的重要前提，同時(shí)也是配子成熟過(guò)程的必需步驟。

5.不同細(xì)胞周期對(duì)重編程的影響 正常的細(xì)胞周期分為細(xì)胞間期和有絲分裂期兩大階段。其中，細(xì)胞間期以DNA合成為標(biāo)志，又可分為G0期（靜止期），G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期）和G2期（合成其他必需物質(zhì)）。細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過(guò)“Cyclins-CDKs-CKIs”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中CDKs（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶）為該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclins（細(xì)胞周期蛋白）對(duì)CDKs具有正性調(diào)控作用，而CKIs（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子）具有負(fù)性調(diào)控作用。Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)必須在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)的嚴(yán)格檢控下調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行。這些檢驗(yàn)點(diǎn)分別為 G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)、S期檢驗(yàn)點(diǎn)、G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)、紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)。研究表明，生長(zhǎng)因子、環(huán)核苷酸類、某些離子等都可誘發(fā)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使DNA開(kāi)始復(fù)制。在S期，細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶活性達(dá)到高峰。當(dāng)DNA發(fā)生損傷、復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常時(shí)，細(xì)胞周期將被阻斷。

1992年的研究結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞或卵裂球的M期進(jìn)行核移植可誘導(dǎo)重編程的發(fā)生，而在細(xì)胞間期卻不行，或是成功率很低。2004年，有人提出影響重編程的因素可能位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核，提示細(xì)胞質(zhì)中可能存在某些特定物質(zhì)影響重編程的發(fā)生，且這些物質(zhì)隨著細(xì)胞周期而周期性復(fù)活與消失。也有學(xué)者認(rèn)為，在細(xì)胞間期，影響重編程因子可能濃聚于細(xì)胞核附近，去核時(shí)容易隨核移出，不利于供體核重編程的發(fā)生;而在M期，重編程因子廣泛彌散于細(xì)胞質(zhì)中，去核時(shí)并不會(huì)過(guò)多的帶走，有利于供體核重編程。