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    應(yīng)用ISSR 技術(shù)鑒定杭白菊對(duì)葉斑病的抗性

    2014-12-23 11:30:06郭慶海李丹霞王康才薛友榮周雪松陳志祥
    關(guān)鍵詞:葉斑病紅心菊花

    郭慶海, 李丹霞, 王康才, 薛友榮, 周雪松, 陳志祥

    (1.江蘇省濱??h植保植檢所,江蘇 濱海224500;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京210095;3.江蘇省濱海縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 濱海224500;4.江蘇省射陽縣盛大藥材有限公司,江蘇 鹽城224300)

    杭菊花是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用藥用植物,隨著人們生活水平提高,保健意識(shí)加強(qiáng),其市場(chǎng)需求逐年增加,種植面積也隨之?dāng)U大,但在老產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn),由于連作,菊花病害尤其是菊花葉斑病等病害成為限制農(nóng)民增產(chǎn)增收的障礙[1]。病害的判斷診治主要靠常規(guī)手段,用分子手段進(jìn)行病害的鑒定分類則較少,張欣[2]應(yīng)用RAPD 技術(shù)區(qū)別芒果抗炭疽病品種,李海生[3]利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了植物遺傳多樣性的分析應(yīng)用,高山等以ITS1 和ITS4 為 引 物擴(kuò)增病原菌的ITS 片段,對(duì)葉斑病進(jìn)行分子鑒定[4]。張正光等進(jìn)行ITS 序列分析確定了根腐病的病原菌[5]。ISSR 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(Inter-simple sequence repeat,ISSR )是一種基于微衛(wèi)星(Simple sequence repeat,SSR)序列發(fā)展起來的、利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的、十分有效的分子標(biāo)記技術(shù),廣泛應(yīng)用于植物遺傳關(guān)系及遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)演化等方面研究。作為一種新型的分子標(biāo)記,ISSR 標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和SSR 的優(yōu)點(diǎn),具有模版需要量少,多態(tài)性豐富,無需試劑盒,結(jié)果記錄方便,試驗(yàn)成本低,操作簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn),但目前未見利用ISSR 技術(shù)鑒別菊花抗葉斑病品種的相關(guān)報(bào)道。為此,本試驗(yàn)采用ISSR 技術(shù)對(duì)20 個(gè)杭白菊材料(其中10 個(gè)材料為抗病材料)的抗病性育成品種的早期確定、抗病品種的鑒定及抗病機(jī)理等進(jìn)行研究,以期為菊花抗葉斑病品種篩選、品種鑒定提供一種有效的輔助手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    20 種材料采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地,均為江蘇省濱??h植保植檢所菊花課題組前期選育,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系王康才教授鑒定。品種名、田間抗性見表1。試驗(yàn)材料包括杭白菊的2個(gè)品系新白品系(新白)和紅心品系(其他19 個(gè)品種),其中新×香、紅心11×香菊和紅心11×菊花腦3個(gè)材料為雜交材料。

    1.2 方法

    采用改良的CTAB 法提取菊花基因組DNA[6],1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度,稀釋至50 ng/μl。ISSR-PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μl,其中包括200.0 μmol/L dNTP、0.5 μmol/L primer、10×PCR buffer、50 ng DNA template、1.5 U DNA polymerase、無菌水。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD 公司MJ Mini 48 孔梯度PCR 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,45 ~55 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸1 min 30 s,39 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后每管加入6×溴酚藍(lán)1 μl,混勻后取10 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠中含有1% 的4S Green。電泳緩沖液為1×TAE,電壓5 V/cm。在上海培青科技有限公司生產(chǎn)的JS-380 型凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)并照相。

    表1 試驗(yàn)材料及其田間抗性Table 1 Accessions used in the study and their field resistance

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

    根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果,在凝膠的某個(gè)相同遷移位置上有DNA 條帶的記為1,無DNA 條帶的記為0,采用POPGENE32 軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、平均有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,He)和 Shannon 信 息 多 樣 性 指 數(shù)(Shannon’s information index,I);用DPS 分析軟件的非加權(quán)配對(duì)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

    2 結(jié)果

    2.1 DNA 提取、引物篩選及多態(tài)性分析

    提取并純化材料DNA,瓊脂糖凝膠電泳確定DNA。

    利用3 個(gè)表型差異大的材料對(duì)100 條ISSR 引物進(jìn)行篩選,確定23 條帶型清晰、多態(tài)性較好的引物對(duì)20 個(gè)試驗(yàn)材料進(jìn)行多態(tài)性分析。淘汰擴(kuò)增效果差、帶型模糊、對(duì)個(gè)別材料擴(kuò)增不出條帶的引物,最終篩選出10 條引物用于20 份材料的遺傳分析。共擴(kuò)增出168 條清晰可辨譜帶,其中多態(tài)性帶135條;平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為80.36%,多態(tài)性較高。擴(kuò)增條帶集中在200 ~2 000 bp(表2)。如表2 所示在綜合比較各引物擴(kuò)增效果后發(fā)現(xiàn)165 號(hào)引物多態(tài)性條帶百分率達(dá)100.00%,故選取165 號(hào)引物作為最理想的引物。圖1 為ISSR 引物165 的擴(kuò)增結(jié)果。

    表2 有效ISSR 引物序列及其多態(tài)性Table 2 Efficient ISSR primer sequences and their polymorphisms

    圖1 ISSR 引物165 對(duì)供試材料的PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplified pattern of Dendranthema morifolium with ISSR 165

    2.2 20 個(gè)菊花品種ISSR 遺產(chǎn)多樣性分析

    平均有效等位基因數(shù)(Ne)和Nei’s 基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,He)是衡量遺傳變異最常用的2 個(gè)遺傳指標(biāo),具有明顯的遺傳學(xué)意義[6]。Shannon 信息指數(shù)方便與同類研究進(jìn)行比較[7]。利用軟件包POPGENE32 對(duì)各位點(diǎn)的Ne、He以及Shannon 信息指數(shù)進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果顯示,20 個(gè)品種平均有效等位基因數(shù)為1.549 1,平均Nei’s 基因多樣性 指 數(shù) 為0.312 9,平 均 Shannon 信 息 指 數(shù)為0.458 8。本研究擴(kuò)增的ISSR 片段多態(tài)性較高,說明在進(jìn)化過程中,菊花栽培品種在DNA 分子水平上形成并保持了較高的遺傳變異,還可能與菊花品種存在自交不親和性[8-9]及無性繁殖有關(guān)。

    2.3 菊花對(duì)葉斑病抗性與其ISSR 聚類組的相關(guān)性分析

    由圖2 可以看出,以遺傳距離為0.38 處劃分,20 個(gè)菊花品種聚類為3 個(gè)ISSR 組:第1 組包括大花2 號(hào)、大花4 號(hào)、優(yōu)單4 號(hào)、優(yōu)單6 號(hào)、紅心9 號(hào)、紅心13 號(hào)、紅心19 號(hào)、紅心1 號(hào)、紅心20 號(hào)、單瓣2號(hào),這一組均是高感、中感品種;第2 組包括NJK1、NJK2、NJK3、似貢3 號(hào)、紅心11 號(hào)、新×香、紅心11×香、紅心11×腦、NJK4,具有抗葉斑病的品種都聚在這一類;第3 組只有一個(gè)品種,是新白。

    圖2 20 個(gè)菊花品種ISSR 標(biāo)記的UPGMA 聚類圖Fig.2 Dendrogram of 20 Dendranthema morifolium cultivars based on ISSR markers by UPGMA

    對(duì)20 種菊花材料運(yùn)用POPGENE 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果(表3)顯示,在20 種菊花材料中,H最大值為0.498 7,最小值為0.05;I最大值為0.693 1,最小值為0.119 3。這些結(jié)果顯示出試驗(yàn)材料存在著豐富的遺傳變異,推測(cè)與菊花長(zhǎng)期的自然雜交、自然選擇和人工選育造成的復(fù)雜的遺傳背景有關(guān),這說明菊花具有極其豐富品種的分子基礎(chǔ)。在分成2 個(gè)類群的基礎(chǔ)上,比較抗性材料與感病材料可知:抗性材料的Ne、H及I值均高于感病材料,說明抗性材料之間比易感病材料之間基因差異顯著,抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高。

    表3 POPGENE 軟件分析結(jié)果Table 3 The results analyzed by POPGENE software

    從ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果來看,聚類結(jié)果與杭菊花對(duì)葉斑病的田間抗性有明顯的相關(guān)性,基本能夠區(qū)分抗性品種和易感品種。

    3 討論

    從ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果來看,聚類結(jié)果與菊花對(duì)葉斑病的田間抗性有明顯的相關(guān)性。所有抗性材料除了新白全部聚為抗葉斑病品種,除此之外,3 個(gè)雜交品種也聚到這一大組中,這個(gè)結(jié)果也說明了雜交技術(shù)在培育抗病新品種中的優(yōu)勢(shì)[10],而所有易感病材料聚為高感、中感品種。新白是另一個(gè)品系的品種,在這里單獨(dú)聚為一類。

    對(duì)易感和具有抗性的2 組試驗(yàn)材料統(tǒng)計(jì)的結(jié)果顯示,抗性材料的平均有效等位基因數(shù)、平均Nei’s基因多樣性指數(shù)及Shannon 信息指數(shù)均高于感病材料,表明抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高??赡苁且?yàn)榭剐缘倪z傳多樣性豐富,包括的抗病基因相對(duì)感病組較多,所以具有抗病性,其具體抗病基因位點(diǎn)仍需要繼續(xù)研究。本研究因時(shí)間和條件限制僅應(yīng)用ISSR 技術(shù)對(duì)菊花抗葉斑病進(jìn)行鑒定,是否可以應(yīng)用ISSR 技術(shù)鑒定菊花甚至其他植物的其他病害仍需繼續(xù)研究。

    ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果表明,利用ISSR 技術(shù)可以鑒定菊花是否抗葉斑病,該技術(shù)可以作為早期篩選抗葉斑病品種的輔助手段。

    [1] 陳長(zhǎng)軍,劉德輝,王康才.江蘇省藥用菊花病害普查[R].沈陽:第六屆中國(guó)植物病害化學(xué)防治學(xué)術(shù)研討會(huì),2008.

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