26 份棉花耐鹽相關種質資源遺傳多樣性SRAP 分析

劉雅輝， 王秀萍， 魯雪林， 張國新， 李九歡， 李 強

(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 曹妃甸063200)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫因子。中國的鹽漬土近1×108hm2，且鹽漬化和次生鹽漬化不斷擴大，鹽漬化土壤結構極差，作物難以正常生長，嚴重影響了作物的產(chǎn)量和品質。因此合理開發(fā)利用鹽堿地是一項迫在眉睫的任務。棉花是中國重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位［1-2］。在糧棉爭地矛盾日益突顯的情況下，棉花以其較好的耐鹽性，逐漸成為鹽堿地一種新的優(yōu)勢作物。目前，中國是世界上鹽堿地植棉規(guī)模最大的國家。據(jù)不完全統(tǒng)計［3］，中國植棉區(qū)內(nèi)鹽堿地約有1.7×108hm2，其中2.7×106hm2先后開發(fā)植棉。因此，選育耐鹽棉花品種是目前解決鹽堿地利用的一種有效手段。但是由于棉花的耐鹽性十分復雜［4］，耐鹽機理尚不是很清楚，這給棉花耐鹽育種帶來很大困難，目前尚缺乏可以在鹽堿地大面積推廣應用的耐鹽品種。因此開展棉花品種的耐鹽鑒定并對耐鹽種質資源進行遺傳多樣性分析，拓寬遺傳基礎，篩選耐鹽新基因，對于開發(fā)利用鹽漬化土壤，擴大棉花種植面積，提高單位產(chǎn)量，具有十分重要的理論價值和實際意義。

SRAP 標記是由美國加州大學蔬菜作物系Li 等［5］提出的，又稱為基于序列擴增多態(tài)性，是一種新型的基于PCR 的標記系統(tǒng)，通過獨特的引物設計對開放閱讀框進行擴增，因不同個體、物種的內(nèi)含子、啟動子及間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標記具有操作簡便、結果穩(wěn)定、在基因組中分布均勻、便于克隆測序目標片段、成本低廉等特點，目前已廣泛應用于各種作物的品種鑒定、遺傳圖譜構建和遺傳多樣性分析等方面的研究［6-9］。在棉花上，也有大量學者利用該技術進行了遺傳多樣性檢測、抗病基因的篩選等方面的研究［10-14］，但將該技術應用于棉花耐鹽性研究還未見報道。

本研究以多年收集、鑒定的黃河流域棉區(qū)具有代表性的26 份棉花耐鹽相關種質資源為試驗材料，利用SRAP 技術進行遺傳多樣性分析，了解該區(qū)域棉花耐鹽品種(品系)間遺傳差異，為有針對性的選用不同類型的耐鹽親本、聚合不同耐鹽基因和進一步提高耐鹽種質資源的耐鹽性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所耐鹽旱作研究室多年收集、鑒定和篩選的26 份棉花耐鹽相關種質資源，具體來源見表1。SRAP 引物參照Li 等［5］公布的通用引物，共組成88 對引物，引物序列由北京華大基因研究中心合成。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽鑒定方法 按照河北省地方標準《棉花耐鹽性鑒定評價技術規(guī)范》［15］中的苗期耐鹽鑒定方法，于河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所濱?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果轉化基地進行耐鹽性試驗。試驗設2 個處理，耐鹽性處理:在池子內(nèi)填加混合均勻的土壤全鹽含量為0.4%的鹽堿原土，處理期間根據(jù)日蒸發(fā)量的大小，噴施一定量淡水，使鹽堿土含鹽量盡量保持恒定。對照:池子內(nèi)填加土壤全鹽含量為≤0.1%的土壤，試驗期間管理同耐鹽性處理。3 次重復。觀察記載植株的葉片形狀、顏色和受害癥狀，進行苗情分類，然后計算鹽害指數(shù)，鹽害指數(shù)分級標準:鹽害指數(shù)≤15.0%為1 級，極強耐鹽;15.1% ～30.0%為2 級，強耐鹽;30.1% ～60.0%為3 級，耐鹽;60.1% ～85.0% 為4 級，弱耐鹽;85.1% ～100.0%為5 級，極弱耐鹽。

1.2.2 基因組DNA 提取與檢測 利用北京康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)的CottonGenDNAkit 對供試材料進行DNA 的提取，然后用北京普析通用儀器有限責任公司生產(chǎn)的TU-1810 紫外分光光度計檢測DNA 純度與濃度。

1.2.3 PCR 擴增和產(chǎn)物檢測 PCR 反應體系為20.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，5 U/μlTaq酶0.2 μl，30 ng/μl 模板DNA 1.0 μl，50 ng/μl 正反引物各0.7 μl，PCR 染料2.0 μl，ddH2O 13.0 μl。PCR 反應在Eppendorf mastercycler gradient 基因擴增儀中進行。PCR 擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72℃延伸10 min，共5 個循環(huán)，然后將退火變?yōu)?0 ℃，在進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，觀察統(tǒng)計帶型。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 觀察PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳結果，統(tǒng)計清晰穩(wěn)定且易于辨認的條帶。在同一基因位點上，每個樣品擴增條帶按有無記錄，擴增條帶存在時記為1，不存在時記為0。利用軟件NTSYS-pc2.1 計算各材料間Jaccard 遺傳相似性系數(shù)，并用類平均法(UPGMA)對所有材料進行聚類。

2 結果

2.1 供試材料的耐鹽鑒定

26 份材料的耐鹽鑒定結果(表1)顯示，有3 份材料表現(xiàn)為強耐鹽，4 份材料耐鹽性弱，其余都為耐鹽材料?？梢姶蟛糠植牧隙际悄望}材料，強耐鹽或耐鹽性弱材料各占10%左右。

2.2 SRAP 多態(tài)性引物的篩選

首先選用耐鹽差異大的2 個材料NY1 和新研96-48，對88 對引物進行篩選，40 對引物有擴增條帶，且有多態(tài)性，然后用40 對引物對所有材料進行擴增，最終有29 對引物的擴增產(chǎn)物多態(tài)性高，帶型清晰。

2.3 SRAP 多態(tài)性分析

用29 對引物組合在26 份材料中共擴增出780 個位點，多態(tài)性位點238 個，多態(tài)率達30.51%，每個引物組合的多態(tài)性位點為2 ～13 個，平均每個引物組合產(chǎn)生8.2 個多態(tài)性位點。其中，22 個強耐鹽和耐鹽材料在29 對引物中均具有多態(tài)性，多態(tài)性位點達128 個，4 個耐鹽性弱的材料在15 對引物中具有多態(tài)性，多態(tài)性位點為25 個。

2.4 遺傳相似性分析

利用軟件NTSYS-pc2.1 計算各材料間Jaccard 遺傳相似性系數(shù)，結果顯示，26 個材料間的相似系數(shù)為 0.565 ～0.973，平均值0.767，分布在0.7 ～0.8 區(qū)間的占84.10%，其中自主選育的NY1 與遼棉16 的相似系數(shù)最小，為0.565，說明它們間的親緣關系較遠，遺傳差異大;中棉所35 與中棉所49 的相似系數(shù)最大，為0.973，其次是邯棉103 與邯棉5158，為0.957，說明它們之間的親緣關系較近。

22 個強耐鹽和耐鹽材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.565 ～0.973，平均值為0.782，4 個耐鹽性弱的材料的遺傳相似系數(shù)為0.733 ～0.859，均值為0.807。耐鹽(強耐鹽和耐鹽)和耐鹽性弱的材料間的遺傳相似系數(shù)大多數(shù)為0.7 ～0.8?？梢?，本研究大部分材料的遺傳相似系數(shù)較高。

表1 26 份材料名稱、來源及耐鹽性鑒定結果Table 1 Names，origins and salinity tolerances of 26 cotton materials

2.5 聚類分析

利用軟件NTSYS-pc2.1 用類平均法(UPGMA)對所有材料進行聚類分析，在閾值為0.72 時，26 份材料被分成3 個類群，其中第一類群只包括1 份材料(遼棉16)，第二類群包括2 份材料(枝棉3 號和NY1)，其余23 份材料聚到第三類群。第三類群又可以分為2 個亞類，第一亞類包含21 份材料，第二亞類只包含2 份材料(衡棉4 和冀豐106)。

從聚類圖還可以看出，一些耐鹽性相同的材料分布較集中，如閾值為0.8 時，第三類群的第一亞類中除了新研96-48，大多數(shù)材料均為耐鹽材料;而第二亞類中，除了魯棉17和豫棉21，均為耐鹽性弱材料。絕大部分有親緣關系的材料聚為一類，說明該分析結果和系譜分析基本吻合。

3 討論

SRAP 分子標記技術是在總結已有標記技術的優(yōu)缺點之后開發(fā)的新型標記技術，具有引物設計簡單，穩(wěn)定性強等優(yōu)點;它不需要進行SSR 那樣復雜的引物開發(fā)，降低了RFLP 標記對DNA 濃度和純度的高要求，取消了AFLP 的預擴增和連接步驟，比RAPD 更加高效，這些優(yōu)點已在各種作物的廣泛應用中得到證實。本研究結果也證明，SRAP 技術具有簡單、穩(wěn)定性高、重復性好的特點，而且條帶清晰，擴增效果良好，多態(tài)性較高，能夠較好地反映棉花耐鹽相關種質資源的遺傳多樣性，是研究遺傳變異的一種有效手段。

本研究利用SRAP 技術從分子水平上對中國黃河流域中早熟棉區(qū)部分陸地棉耐鹽相關種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明多數(shù)材料的遺傳相似系數(shù)都在0.7 以上，可見本研究所選的材料間遺傳相似性較高，說明中國黃河流域中早熟棉區(qū)陸地棉耐鹽種質資源遺傳基礎狹窄，這與前人［16-18］的研究結果具有一致性。陸地棉以外的其他栽培種、遠緣野生種及棉屬的一些野生種等材料，具有豐富的遺傳多樣性和突出的抗逆性，可能含有許多耐鹽基因［19］，因此我們要注重這些資源的搜集、引進，并合理利用這部分資源，拓寬中國棉花耐鹽種質的遺傳基礎。從聚類圖上看，分布在不同類群的材料，由于遺傳相似系數(shù)小，遺傳差異較大，相互雜交更易發(fā)揮超親優(yōu)勢。因此在棉花耐鹽育種中盡量選擇遺傳相似系數(shù)小，耐鹽差異大的材料配置雜交組合。

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