幾種雅羅魚(yú)亞科魚(yú)類基于mtDNA 序列的親緣關(guān)系

竇新杰， 常玉梅， 唐 然， 陶 然，3， 梁利群

(1.淡水魚(yú)類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;3.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波315211)

雅羅魚(yú)亞科(Leuciscinae)隸屬于鯉形目(Cyprinoidei)鯉科(Cyprinidae)，在中國(guó)南北方均有分布，其中北方主要以雅羅魚(yú)屬(Leuciscus cuvier)為主［1-2］。雅羅魚(yú)屬約有20 種［1］，在中國(guó)有7 種，其中瓦氏雅羅魚(yú)(L.waleckii)主要分布于黑龍江流域包括呼倫湖、黑龍江、松花江、烏蘇里江，此外在達(dá)里湖、岱海灤河、黃河、遼河以及俄羅斯境內(nèi)的黑龍江上游江段也有少量分布;圖們雅羅魚(yú)(L.waleckii tumensisMori)分布于圖們江;準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)(Leuciscus merzbacheri)分布于準(zhǔn)噶爾盆地;高體雅羅魚(yú)(L.idus)和貝加爾雅羅魚(yú)(L.leuciscus baicalebsis)主要分布在中國(guó)新疆額爾齊斯河水系。灘頭雅羅魚(yú)(Tribolodon branditDybowski)和珠星雅羅魚(yú)(L.haronensisGunther)也主要分布在中國(guó)北方綏芬河和圖們江流域［3-4］，并且有海邊(半咸水區(qū))溯河產(chǎn)卵現(xiàn)象。這些種類在分布區(qū)是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚(yú)類。

雅羅魚(yú)亞科的魚(yú)類具有對(duì)不良環(huán)境超強(qiáng)的適應(yīng)性。如瓦氏雅羅魚(yú)能夠在pH 9.6，堿度高達(dá)50 mmol/L的高鹽堿湖泊-達(dá)里湖中生存［5-8］，而珠星雅羅魚(yú)能夠在pH3.5 的酸性湖泊-日本宇曾利山湖中存活［9］。那么，對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)是否造成不同種群遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，以及這種變異是否導(dǎo)致不同種群進(jìn)化成不同的物種?池炳杰等［10］利用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)了瓦氏雅羅魚(yú)淡水群體和堿水群體的遺傳組成，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)群體出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，除有限的基因交流造成的地域種群分化外，由環(huán)境因子(如堿度)誘發(fā)的自然選擇作用也是導(dǎo)致不同群體分化的主要進(jìn)化力量［11］。此外，灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)由于生活環(huán)境的不同(海水或酸性水)，有些學(xué)者依據(jù)表型和遺傳數(shù)據(jù)將這2 個(gè)種劃分為3 塊魚(yú)屬而非雅羅魚(yú)屬［12］。劉金亮等［13］利用微衛(wèi)星標(biāo)記估算了4 個(gè)雅羅魚(yú)種5 個(gè)不同群體的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)貝加爾雅羅魚(yú)和高體雅羅魚(yú)遺傳距離小，聚為一類，并與灘頭雅羅魚(yú)的遺傳距離較近;瓦氏雅羅魚(yú)的達(dá)里湖群體和松花江群體遺傳距離小，聚為另一類。

動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，在進(jìn)化過(guò)程中與核基因平行進(jìn)化，屬于母系遺傳，具有進(jìn)化速率快，不易發(fā)生重組等特點(diǎn)，是目前分析群體遺傳結(jié)構(gòu)、種間遺傳分化以及種屬親緣關(guān)系鑒定的重要工具［14-15］。本研究選擇mtDNA 的COI、Cytb和Dloop3 個(gè)基因，對(duì)瓦氏雅羅魚(yú)的2 個(gè)地理群體(松花江雅羅魚(yú)和達(dá)里湖雅羅魚(yú))、高體雅羅魚(yú)、貝加爾雅羅魚(yú)、灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)進(jìn)行遺傳多樣性分析，探究這幾種魚(yú)類之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為進(jìn)一步探討雅羅魚(yú)亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及種屬劃分提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共收集到雅羅魚(yú)亞科隸屬于2 個(gè)屬的6個(gè)種群樣本(表1)。其中雅羅魚(yú)屬包括瓦氏雅羅魚(yú)的2 個(gè)地理群體(松花江群體，SHJ;達(dá)里湖群體，DL)、高體雅羅魚(yú)(GT)和貝加爾雅羅魚(yú)(BJ);三塊魚(yú)屬包括灘頭雅羅魚(yú)(TT)和珠星雅羅魚(yú)(ZX)。樣本采集地分別是松花江綏濱段、內(nèi)蒙古達(dá)里湖、新疆額爾齊斯河、新疆賽里木湖、黑龍江綏芬河、日本宇曾利山湖(Kaneko 教授惠贈(zèng))。所有樣本鰭條于95%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 6 個(gè)雅羅魚(yú)群體的樣本信息Table 1 Sampling information of six populations

1.2 基因組DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增

基因組DNA 的提取方法為常規(guī)的酚-氯仿法，具體步驟參照劉金亮等［13］的方法。COI和D-loop引物［16-17］適用于所有樣本，而參照孔慶鵬等的Cytb引物［18］僅適用于雅羅魚(yú)屬。因此，根據(jù)NCBI 上已公布的灘頭雅羅魚(yú)的Cytb序列，利用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表2。PCR 反應(yīng)體系為50 μl，包括35 μl 自制混合Buffer(包括50.0 mmol/L KCl、10.0 mmol/L Tris-HCl、0.10% TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl2、0.10% NP-40、0.01%明膠、4 種dNTP)，濃度為10.0 mmol/L上、下游引物各0.75 μl，50 ng 的基因組2 μl，TaqDNA 聚合酶1U(Fermentas)、去離子無(wú)菌水補(bǔ)至總體積50 μl。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;35 個(gè)循環(huán)包括94℃30 s，55 ℃或52 ℃30 s(表2)，72 ℃1 min;最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海立菲生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

表2 COI、Cytb 和D-loop 的PCR 引物信息Table 2 Information of PCR primers for three regions of mtDNA

1.3 序列處理及分析

利用Clustalx1.8 和Bioedit7.0 分別對(duì)COI、Cytb和D-loopmtDNA 基因序列進(jìn)行多重比對(duì)、校正。利用MEGA5.1 計(jì)算序列4 種核苷酸組成比例、堿基轉(zhuǎn)換∕堿基顛換值(R)，基于Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算種間遺傳距離，用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ 法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap (重復(fù)1 000 次)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度。利用DNAsp5.0 計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣(Pi)以及平均核苷酸差異數(shù)(K)。利用Arlequin3.1 進(jìn)行種內(nèi)及種間的分子方差分析(AMOVA)。

2 結(jié)果

2.1 COI 基因多樣性

序列經(jīng)比對(duì)校正后，得到COI部分的有效序列長(zhǎng)度為635 bp。COI基因在6 個(gè)種群中共分析了39 條有效序列。核苷酸組成分析結(jié)果顯示，腺嘌呤(A )、胸腺嘧啶(T)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)4 種堿基的平 均 含 量 依 次 為24.53%、28.13%、19.05% 和18.19%，A + T 含量(52.70%)略高于G + C 含量(47.3%)，堿基轉(zhuǎn)換與堿基顛換比(R)為3.394。單倍型分析顯示，所有樣本共有16 個(gè)單倍型，其中DL和SHJ 共享單倍型且數(shù)量為2 個(gè);GT 和ZX 各獨(dú)享1個(gè)單倍型(表3)。遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，貝加爾雅羅魚(yú)(BJ)和灘頭雅羅魚(yú)(TT)的遺傳多樣性最高，其次為瓦氏雅羅魚(yú)的DL 和SHJ 群體，高體雅羅魚(yú)(GT)和珠星雅羅魚(yú)(ZX)未檢測(cè)到遺傳變異(表3)。

2.2 Cytb 和D-loop 基因多樣性

由于Cytb和D-loop分析的樣本相同，因此將這2個(gè)基因序列整合為1 個(gè)長(zhǎng)度為1 095 bp 的片斷(Cytb-D-loop)，共分析了39 條有效序列。核苷酸組成分析結(jié)果顯示，A、T、G 和C 4 種堿基的平均含量分別為27.93%、31.21%、15.90% 和24.96%，A + T 含 量(59.14%)明顯高于G+C 含量(40.86%)，堿基轉(zhuǎn)換與堿基顛換比(R)為3.27。所有樣本共檢測(cè)到34 個(gè)單倍型，其中貝加爾雅羅魚(yú)(BJ)享有單倍型數(shù)最多為11 個(gè);珠星雅羅魚(yú)(ZX)享有的單倍型數(shù)最少為3個(gè)，其余種群的單倍型數(shù)為4 ～6 個(gè)(表4)。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，6 個(gè)種群的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)普遍較高，其中，貝加爾湖雅羅魚(yú)(BJ)和高體雅羅魚(yú)(GT)各項(xiàng)參數(shù)值比較接近;瓦氏雅羅魚(yú)的DL 和SHJ群體的遺傳多樣性相近，而灘頭雅羅魚(yú)(TT)與珠星雅羅魚(yú)(ZX)數(shù)值差異大(表4)。

表3 6 個(gè)雅羅魚(yú)種群COI 基因的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of six populations based on COI gene

表4 6 個(gè)雅羅魚(yú)種群Cytb-D-loop 基因的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Cytb-D-loop gene of six populations

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

圖1 基于COI 基因的種間遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree constructed with COI gene mtDNA

以Kimura 為雙參數(shù)模型計(jì)算6 個(gè)雅羅魚(yú)種群間的遺傳距離?；贑OI基因的遺傳距離顯示，6個(gè)種群聚為2 大分支，其中SHJ、DL、GT 和BJ 親緣關(guān)系較近，聚為一支，而TT 和ZX 聚為另一支(圖1)，該聚類支持6 個(gè)種群分屬2 個(gè)屬，即雅羅魚(yú)屬和三塊魚(yú)屬。在雅羅魚(yú)屬的4 個(gè)種群中，瓦氏雅羅魚(yú)的2 個(gè)群體的遺傳距離最近為0.002，GT 與BJ 之間的距離為0.072，分別與SHJ 和DL 的遺傳距離介于0.068 ～0.082;三塊魚(yú)屬中的TT 和ZX 2 個(gè)物種的遺傳距離為0.045，與另外4 個(gè)種群間的距離介于0.137 ～0.161(表5)。基于Cytb-D-loop基因的親緣關(guān)系聚類結(jié)果顯示，ZX 單獨(dú)聚為一支，且與另外5 個(gè)種群間的遺傳距離較遠(yuǎn)，介于0.170 ～0.283(表5);除此之外，其他種群的聚類結(jié)果與COI相似(圖2)。

種群遺傳分化指數(shù)分析顯示，瓦氏雅羅魚(yú)種內(nèi)的2 個(gè)地理群體在COI和Cytb-D-loop2 個(gè)mtDNA區(qū)段均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的遺傳分化(P＞0.05)，而不同種間相比，6 個(gè)種群在COI和Cytb-D-loop區(qū)段出現(xiàn)了不同程度的遺傳分化(P＜0.05)(表5)。對(duì)6個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)按照種屬關(guān)系進(jìn)行2 個(gè)層次的分子生物學(xué)方差分析。其中，按照雅羅魚(yú)屬(SHJ、DL、GT、BJ)和三塊魚(yú)屬(TT、ZX)2 個(gè)屬劃分，組間遺傳結(jié)構(gòu)有明顯分歧(P＜0.05);按照瓦氏雅羅魚(yú)(SHJ、DL)、高體雅羅魚(yú)、貝加爾雅羅魚(yú)、灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)5 個(gè)種劃分，組間差異不顯著(P＞0.05)。

表5 基于COI 和Cytb-D-loop 基因的6 個(gè)雅羅魚(yú)種群間的遺傳分化指數(shù)和遺傳距離Table 5 The genetic differentiation index and genetic distance among six poputations based on COI and Cytb-D-loop genes

圖2 基于Cytb-D-loop 基因的種間遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed with Cytb-D-loop gene mtDNA

2.4 種群特異位點(diǎn)的鑒定

對(duì)6 個(gè)種群所特有的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，沒(méi)有找到能夠區(qū)分瓦氏雅羅魚(yú)2 個(gè)地理群體的特異位點(diǎn)，因此按照5 個(gè)種群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在COI和Cytb-Dloop2 個(gè)區(qū)段均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)種群特異位點(diǎn)，其中，珠星雅羅魚(yú)擁有的特異位點(diǎn)數(shù)最多(53 個(gè))，依次為瓦氏雅羅魚(yú)(47 個(gè))、貝加爾雅羅魚(yú)(31 個(gè))、灘頭雅羅魚(yú)(27 個(gè))和高體雅羅魚(yú)(22 個(gè))(表6)。

表6 基于COI 和Cytb-D-loop 基因的6 個(gè)雅羅魚(yú)種群的特異位點(diǎn)數(shù)Table 6 The specific loci on COI 和Cytb-D-loop genes of mtDNA differentiating six populations

3 討論

3.1 群體的遺傳多樣性

基于6 個(gè)種群的COI和Cytb-D-loop基因核苷酸組成分析，結(jié)果顯示4 種堿基含量不均一，而且A+T 的比例均高于G+C 的比例，與脊椎動(dòng)物mtDNA 的特點(diǎn)一致［20］。mtDNA 2 個(gè)基因區(qū)段的堿基轉(zhuǎn)換與堿基顛換比(R)依次為3.94 和3.27，這一結(jié)果符合脊椎動(dòng)物線粒體基因組進(jìn)化時(shí)堿基轉(zhuǎn)換高于堿基顛換的規(guī)律;有研究認(rèn)為當(dāng)R值小于2 時(shí)基因的序列突變達(dá)到飽和，在構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的過(guò)程中受進(jìn)化噪音的影響易出現(xiàn)錯(cuò)誤信息［21］，本研究中的R值均大于2，可進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。從遺傳多樣性上來(lái)看，6 個(gè)種群在Cytb-D-loop區(qū)段的多樣性水平均較高，而在COI區(qū)域變異較大，有的種群甚至沒(méi)有出現(xiàn)遺傳變異。有報(bào)道認(rèn)為，由于不編碼蛋白質(zhì)，D-loop區(qū)域受進(jìn)化選擇的影響小，進(jìn)化速度快，在不同物種或同一物種的不同群體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性［22］，這與我們的研究結(jié)果是一致的。

3.2 群體遺傳分化及親緣關(guān)系

從分組的分子生物學(xué)方差分析結(jié)果可以看出，將6 個(gè)種群分為同一個(gè)組，結(jié)果顯示組內(nèi)差異明顯，說(shuō)明6 個(gè)種群可能具有不同的種屬來(lái)源;按照雅羅魚(yú)屬(SHJ、DL、GT 和BJ)和三塊魚(yú)屬(TT、ZX)分組，結(jié)果顯示組間差異顯著，說(shuō)明這6 個(gè)種群可能來(lái)源于不同的屬;按照瓦氏雅羅魚(yú)(SHJ、DL)、高體雅羅魚(yú)(GT)、貝加爾雅羅魚(yú)(BJ)、灘頭雅羅魚(yú)(TT)和珠星雅羅魚(yú)(ZX)5 個(gè)種劃分，結(jié)果顯示組間差異不顯著，說(shuō)明這5 個(gè)種親緣關(guān)系較近。

具體來(lái)看，DL 和SHJ 2 個(gè)地理群體的遺傳距離最近，在COI和Cytb-D-loop區(qū)段上的遺傳距離依次為0.002 和0.005，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上始終聚在一起，此外，在本研究分析的2 個(gè)mtDNA 區(qū)段內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠區(qū)分這2 個(gè)地理群體的特異位點(diǎn)，但是作為同一個(gè)種，卻發(fā)現(xiàn)很多共有且有別于其他4 個(gè)種群的種內(nèi)特異位點(diǎn)，說(shuō)明DL 和SHJ 2 個(gè)群體并沒(méi)有因?yàn)闂h(huán)境的巨大差異而出現(xiàn)明顯的群體分化，應(yīng)歸屬為瓦氏雅羅魚(yú)種的2 個(gè)地理群體。池炳杰等［10］和Chang 等［11］利用SSR 標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，達(dá)里湖水系和黑龍江水系的瓦氏雅羅魚(yú)種群由于有限的基因交流和對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性，2 個(gè)水系的群體出現(xiàn)了明顯的遺傳分化。但是否將這2 個(gè)水系的群體劃分為2 個(gè)亞種，論據(jù)尚不充分。

貝加爾雅羅魚(yú)和高體雅羅魚(yú)在COI和Cytb-Dloop基因區(qū)段上遺傳距離分別為0.072 和0.052，種群遺傳分化檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BJ 和GT 種群在COI和Cytb-D-loop出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，而且在2 個(gè)基因區(qū)段分別發(fā)現(xiàn)了多個(gè)種內(nèi)特異位點(diǎn)，應(yīng)劃分為2 個(gè)不同的種，這與胡文閣等［23］的研究結(jié)果是一致的，但是系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)支持將這兩個(gè)種群聚為一支，說(shuō)明這2 個(gè)種群親緣關(guān)系較近。本研究中基于mtDNA 的聚類分析顯示，瓦氏雅羅魚(yú)(SHJ、DL)、高體雅羅魚(yú)(GT)、貝加爾雅羅魚(yú)(BJ)聚為一個(gè)大的分支，陳星玉［24］的研究發(fā)現(xiàn)，貝加爾雅羅魚(yú)在骨骼結(jié)構(gòu)上與瓦氏雅羅魚(yú)接近。因此推斷瓦氏雅羅魚(yú)、高體雅羅魚(yú)和貝加爾雅羅魚(yú)具有屬內(nèi)水平的種間親緣關(guān)系。

COI相對(duì)于Cytb和D-loop最為保守，進(jìn)化速度最慢，更適合遠(yuǎn)緣物種進(jìn)化研究［25］。本究中灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)在COI區(qū)域與另外4 個(gè)種群的遺傳距離為0.137 ～0.147 和0.154 ～0.161。張鳳英等［26］在比較2 種鯛屬魚(yú)類線粒體COI基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，屬間遺傳距離介于0.138 ～0.182;Costa 等［27］在對(duì)澳大利亞122 個(gè)魚(yú)屬的COI條形碼研究中發(fā)現(xiàn)，屬間最大的遺傳距離不超過(guò)0.206。根據(jù)遺傳距離和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果以及分子生物學(xué)方差分析檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，TT 和ZX 種群與其他種群為屬間親緣關(guān)系，這與生物學(xué)分類的結(jié)果是一致的，即灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)應(yīng)劃分為雅羅魚(yú)亞科的三塊魚(yú)屬。

根據(jù)黃小彧等［28］基于COI界定的種間劃分依據(jù)(0.05 ～0.30)來(lái)看，TT 和ZX 種群在COI的遺傳距離僅為0.045，不支持種間關(guān)系。但是二者在COI區(qū)域存在明顯的遺傳分歧，且在2 個(gè)mtDNA 區(qū)段均能找到多個(gè)種內(nèi)特異位點(diǎn)，而同為種內(nèi)關(guān)系的DL和SHJ 群體在2 個(gè)基因區(qū)段遺傳分歧不明顯，也沒(méi)有群體特異位點(diǎn)，說(shuō)明灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)存在顯著差異;此外，陳金平［12］在探究綏芬河三塊魚(yú)屬的分類中發(fā)現(xiàn)，灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)在磷片組成和骨骼結(jié)構(gòu)上也存在明顯差異;此外，本研究采集的這2 個(gè)種群地理隔離比較遠(yuǎn)，棲息環(huán)境差異大(海水、酸湖)。因此，結(jié)合前人和我們的研究結(jié)果，將灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)劃分為三塊魚(yú)屬的2 個(gè)不同的種比較合理。

總之，基于遺傳距離、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及種內(nèi)特異位點(diǎn)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為SHJ 和DL 2 個(gè)地理群體親緣關(guān)系近，同屬于瓦氏雅羅魚(yú);高體雅羅魚(yú)和貝加爾雅羅魚(yú)親緣關(guān)系近，且與瓦氏雅羅魚(yú)存在屬內(nèi)親緣關(guān)系，同屬于雅羅魚(yú)亞科的雅羅魚(yú)屬;灘頭雅羅魚(yú)和珠星雅羅魚(yú)親緣關(guān)系近，且與雅羅魚(yú)屬的4 個(gè)種群存在屬間親緣關(guān)系，同屬于雅羅魚(yú)亞科的三塊魚(yú)屬。

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