殷 捷, 凌英會(huì), 丁建平, 王麗娟, 張運(yùn)海, 章孝榮
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽 合肥230036;2.安徽省地方畜禽遺傳資源保護(hù)和生物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥230036)
磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)是通過(guò)抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù)篩選的肥胖與正常人腹膜后脂肪組織中差異表達(dá)基因[1]。Wang 等[2]發(fā)現(xiàn)在肥胖與健康者腹膜后脂肪組織中PID1基因差異表達(dá),且在肥胖者脂肪組織中顯著上調(diào)。PID1基因在脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的作用[3],已有學(xué)者提出將PID1基因作為一個(gè)抑制胰島素而導(dǎo)致肥胖的作用靶位點(diǎn)[4]。PID1基因在脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)目增多,進(jìn)而參與脂肪的發(fā)生發(fā)展[5]。反之,利用基因敲除手段下調(diào)PID1基因表達(dá)量后,脂肪細(xì)胞中胰島素敏感的葡萄糖大量攝取,促進(jìn)IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路,降低葡萄糖的濃度[6]。而且PID1基因參與了多組織胰島素的敏感調(diào)節(jié),脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的高低與脂肪沉積密切相關(guān)[7]。PID1基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新基因,作為一種信號(hào)分子在細(xì)胞生長(zhǎng)和成脂過(guò)程中直接起作用,在脂肪組織中有PID1的高表達(dá)現(xiàn)象。錢源等將豬PID1基因作為重要生產(chǎn)性狀候選基因進(jìn)行研究,通過(guò)肌內(nèi)脂肪(IMF)含量測(cè)定與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性分析,發(fā)現(xiàn)PID1基因與脂肪沉積性狀存在一定的關(guān)系[8]。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證PID1基因?qū)?nèi)脂肪含量這一性狀的影響,篩選影響山羊生長(zhǎng)性狀的候選基因,本研究采用Real time-PCR 技術(shù)對(duì)山羊PID1基因的組織表達(dá)特點(diǎn)以及PID1基因在安徽白山羊不同組織脂肪組織中的表達(dá)水平和肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,從分子水平上揭示PID1基因與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。
試驗(yàn)樣品采自合肥博大牧業(yè)種羊場(chǎng)。選擇0 月齡(6 只)、6 月齡(8 只)和12 月齡(9 只)的安徽白山羊,統(tǒng)一飼養(yǎng)管理,飼喂等量日糧,自由飲水。禁食12 h 后頸靜脈放血屠宰。準(zhǔn)確稱量胴體質(zhì)量后立即取屠體的心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌等10 個(gè)組織樣,標(biāo)記后放入液氮保存,后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存,用于PID1基因表達(dá)分析。另采集腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌約30 g,置于-20 ℃保存,用于測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量。
TIANpure Midi Plasmid Kit、Top10 感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T Simple Vector 為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;RNAiso Plus Total 、RNAPrimeScript RT reagent kit 為TaKaRa 公司產(chǎn)品;SYBR Premix 為羅氏公司產(chǎn)品;引物由華大基因公司合成;StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為美國(guó)ABI 公司;低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5417R)為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品;PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-rad 公司產(chǎn)品。電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品。
取胸肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌,去除可見脂肪,粉碎后采用索氏抽提法分別測(cè)定胸肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌的肌內(nèi)脂肪含量。
1.4.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 取約100 mg 樣品,用TaKaRa 公司的RNAiso Plus Total RNA 試劑提取安徽白山羊各組織的總RNA,將提取到的總RNA 分裝。取2 μl 粗提總RNA 在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)完整性,利用分光光度計(jì)SMA1000 測(cè)定其濃度和純度,檢測(cè)合格的RNA 于-80 ℃中保存?zhèn)溆?。提取的總RNA 按照TaKaRa 公司Prime-Script RT reagent kit 說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 RT-PCR 反應(yīng)與克隆測(cè)序 以cDNA 第一鏈為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,分別對(duì)反應(yīng)條件、循環(huán)數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化。PID1和GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的PCR 反應(yīng)體系均為50.00 μl,其中10 ×Ex Tapbuffer 5.00 μl,Ex TapHS 0.25 μl,dNTP mixture 4.00 μl,上下游引物(20 μmol/L)各1.00 μl,cDNA 模板(50 ng)1.00 μl,ddH2O 34.75 μl。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),采用天根50 bp Marker 作為標(biāo)記。純化的DNA 片段與PMD-18T simple 載體連接,并轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布于固體培養(yǎng)基(33 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂加入1 000 ml 蒸餾水,以1 000∶ 1 的比例加入Amp+)表面,37 ℃培養(yǎng)16 ~18 h 獲得重組子,挑取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,PCR 鑒定后送華大基因公司測(cè)序。
1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及熔解曲線分析 用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x檢測(cè)肌肉組織中PID1mRNA 表達(dá)水平。反應(yīng)體系15.0 μl,包括1.5 μl cDNA,0.9 μl 上下游混合引物,7.5 μl SYBR Green mixture,5.1 μl ddH2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s,60℃31 s,39 個(gè)循環(huán)。
以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為參照基因,SYBR GreenΙ 為熒光染料,采用RT-qPCR檢測(cè)安徽白山羊PID1基因在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌10 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。以cDNA 為模板,用定量引物進(jìn)行檢測(cè),其反應(yīng)體系(15.0 μl)為:1.5 μl cDNA,0.9 μl上下游混合引物,7.5 μl SYBR Green mixture,5.1 μl ddH2O。于ABI StepOne RT-PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行檢測(cè),其反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s,60 ℃31 s,39 個(gè)循環(huán),60 ℃捕捉熒光值。每個(gè)組織重復(fù)檢測(cè)4 次。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析,其中ΔCt=CtPID1-CtGAPDH,ΔΔCt= ΔCt組織-ΔCt腿肌。
根據(jù)GenBank 中已公布的山羊的PID1基因(JN257257)序列,采用premier5.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因上下游引物。以持家基因GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)GenBank 中山羊GAPDH基因(AJ431207.1)序列設(shè)計(jì)引物(表1)。所有引物均由華大基因公司合成。
表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of the target genes
根據(jù)熔解曲線來(lái)判斷PCR 反應(yīng)的特異性,根據(jù)熒光定量PCR 的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的擴(kuò)增效率計(jì)算定量試驗(yàn)結(jié)果。所得結(jié)果采用MX3000p 定量軟件進(jìn)行分析。相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。
選取0 月齡組、6 月齡組和12 月齡組3 個(gè)生長(zhǎng)階段個(gè)體,屠宰后分別測(cè)定背最長(zhǎng)肌、腿肌和胸肌的肌內(nèi)脂肪(IMF)含量。隨著月齡的增加,山羊各部分肌肉肌內(nèi)脂肪含量的發(fā)育性變化模式基本一致,呈上升趨勢(shì),且0 ~12 月齡背最長(zhǎng)肌IMF 含量均顯著高于腿肌和胸肌(表2)。
通過(guò)測(cè)序和Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn),PID1和GAPDH基因的TR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致,同源性在99%以上,其中GAPDH基因同源性為100%。利用實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌10 個(gè)組織中PID1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見圖1。PID1基因在所有組織中均表達(dá),其中在0 月齡肺、6 月齡小腸和脂肪、12 月齡脂肪組織中高度表達(dá),在0 月齡肝、6 月齡肝、脾和肺及12 月齡的脾和肺部組織中度表達(dá),在其余組織中相對(duì)低度表達(dá)。
表2 3 個(gè)組織的肌內(nèi)脂肪含量比較Table 2 The comparison of IMF content among three tissues
圖1 PID1 基因的相對(duì)表達(dá)譜Fig.1 The relative expression level of PID1 gene
由圖2 可見,隨著年齡的增加,肝臟中PID1表達(dá)量呈顯著直線下降趨勢(shì)(P<0.05),脾中PID1表達(dá)量逐漸上升,心PID1表達(dá)量先上升后下降,肺中PID1表達(dá)量先下降后上升;PID1在腎中一直為低表達(dá),12 月齡時(shí)有稍微上升的趨勢(shì);腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌中的PID1基因表達(dá)量均呈上升的趨勢(shì)。
圖2 各組織PID1 基因表達(dá)量的發(fā)育性變化Fig.2 The developmental changes of the expression level of PID1 in tissues
圖3 脂肪組織中PID1 表達(dá)量的發(fā)育性變化Fig.3 The developmental changes of the expression level of PID1 in the adipose
利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)各月齡組山羊PID1基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(圖3)顯示各月齡組間脂肪組織PID1基因表達(dá)水平均差異顯著(P<0.05)。
對(duì)山羊脂肪組織PID1基因mRNA 表達(dá)量及肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析,結(jié)果表明0 ~12 月齡期間PID1基因mRNA 表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌IMF 含量呈顯著相關(guān)(r= 0.968,P<0.05),而PID1表達(dá)量與腿肌(r= 0.910)和胸肌(r= 0.879)IMF 含量間沒有顯著相關(guān)(P>0.05)。
大量遺傳學(xué)、藥理學(xué)和生理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,PID1在細(xì)胞生長(zhǎng)和成脂過(guò)程中起直接調(diào)節(jié)作用,對(duì)于嚙齒類動(dòng)物的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[9]。PID1基因有一個(gè)PTB(磷酸酪氨酸作用位點(diǎn))結(jié)構(gòu)域,與信號(hào)蛋白shc 上PTB 結(jié)構(gòu)域相似,參與生長(zhǎng)因子刺激下細(xì)胞增殖等下游效應(yīng)[10]。PTB 結(jié)構(gòu)域可參與低密度脂蛋白受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在哺乳動(dòng)物中首先作為一種失效(Dab-1)蛋白使小鼠mdabl基因自發(fā)常染色體隱形突變[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在3T3-L1 脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)途徑中胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的基因-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)的表達(dá)[12],明顯促進(jìn)3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖,不影響脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程[13]。同時(shí)張春梅[14]等的研究結(jié)果也證明,PID1基因過(guò)表達(dá)能抑制胰島素刺激直接影響脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取,并抑制葡糖的轉(zhuǎn)換,進(jìn)而影響機(jī)體的胰島素敏感性,導(dǎo)致脂肪組織的沉積。有研究結(jié)果表明,參與能量代謝的基因可能會(huì)影響家畜的重要經(jīng)濟(jì)性狀[15]。這一結(jié)論在陳哲等[16]、王興平[17]等的試驗(yàn)結(jié)果中得到印證。Xu 等[18]從天府山羊中克隆出PID1基因,獲得一段896 bp 的cDNA序列,PID1基因在天府山羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加。
本研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在不同組織(如肺、小腸、脂肪組織、肝、脾)呈中度、高度表達(dá),這與對(duì)豬的研究結(jié)果相符[19]。肝臟中PID1基因表達(dá)顯著降低(P<0.05),而脂肪組織中PID1表達(dá)呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05),這一結(jié)果可能與肝臟是機(jī)體脂肪代謝的重要器官相關(guān)[20]。如果能利用RNAi 等技術(shù)進(jìn)一步降低組織中PID1基因表達(dá)水平,或許能直接觀察到PID1的表型效應(yīng)。PID1基因在不同個(gè)體脂肪組織中表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明,隨著肌內(nèi)脂肪含量的增加,PID1的表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì),且各月齡組之間表達(dá)量差異顯著(P<0.05),這與其在成脂過(guò)程中的調(diào)節(jié)功能是相一致的。進(jìn)一步的相關(guān)分析結(jié)果表明,0 ~12 月齡期間PID1基因的表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量呈顯著相關(guān)(r=0.968,P<0.05),與Xu 等[18]的結(jié)論一致;PID1基因表達(dá)量與0 ~12 月齡腿肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.910,但未達(dá)到顯著水平;PID1基因表達(dá)量與0 ~12月齡胸肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.879,也未達(dá)到顯著水平。以上結(jié)論說(shuō)明PID1基因的表達(dá)量與山羊脂肪沉積有關(guān)聯(lián)。PID1的表達(dá)對(duì)腿肌和胸肌IMF 沒有影響,但不足以說(shuō)明其只對(duì)山羊背最長(zhǎng)肌有影響,因?yàn)橥燃『托丶≈蠭MF 含量差異不顯著,這需要擴(kuò)大群體數(shù)量重新選擇樣本進(jìn)行研究。
本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)對(duì)PID1基因在山羊不同體組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌中均有不同程度的表達(dá)。進(jìn)一步研究PID1基因在不同個(gè)體脂肪組織中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)PID1基因的表達(dá)量均與背最長(zhǎng)肌、腿肌和胸肌IMF 相關(guān)。進(jìn)一步證明了PID1基因可以作為影響山羊育肥性狀的重要分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究,為優(yōu)質(zhì)肉羊的選育提供了理論依據(jù)。
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江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2014年4期