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    PCV2 與PPV 體外混合感染豬肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的影響

    2014-12-23 11:30:14王永帥張雪花劉國(guó)洋侯繼波張道華
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    王永帥,唐 波, 張雪花, 華 濤, 常 晨, 劉國(guó)洋, 侯繼波, 張道華,

    楊德吉1

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京210014)

    豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,為已知的最小的動(dòng)物病毒,是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的必須病原,是危害當(dāng)今全球養(yǎng)豬業(yè)最主要的免疫抑制性疾病之一[1-3]。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)是PCVAD 的一種重要的表現(xiàn)形式,嚴(yán)重影響仔豬斷奶后的生長(zhǎng)發(fā)育[4]。無(wú)論在臨床或?qū)嶒?yàn)條件下,單獨(dú)的PCV2 感染很難誘發(fā)PMWS,在臨床條件下PCV2 與豬細(xì)小病毒(PPV)混合感染可以顯著提高PMWS 發(fā)病率[5-7],另外在試驗(yàn)條件下PPV 已被廣泛應(yīng)用于PMWS 的發(fā)病模型[6,8-9]。PCV2 與PPV 共同的靶細(xì)胞豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)[10-13]是豬體先天性免疫的第一道防線[14],當(dāng)PAMs 感染PCV2 或與PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)混合感染后可以增強(qiáng)IL-10 或TNF-α 等免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的作用,導(dǎo)致免疫抑制或?qū)ωi體先天性免疫產(chǎn)生損傷[15]。PPV 同樣可感染PAMs,而關(guān)于PCV2 與PPV 共同感染PAMs 并對(duì)其細(xì)胞因子影響的研究較少。本研究通過(guò)PCV2 和PPV 混合感染體外豬肺泡巨噬細(xì)胞,測(cè)定兩種病毒在該細(xì)胞中的增殖規(guī)律及不同細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)水平,以闡明PMWS 發(fā)病機(jī)理,為有效預(yù)防和治療該病提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病毒

    PCV2 病毒NJ 株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存,其TCID50為1 ml 105.6。PPV 病毒NJ 株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存,其TCID50為1 ml 107。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

    7 周齡斷奶仔豬,經(jīng)PCR 或RT-PCR 檢測(cè)PRRSV、PCV2、PPV、PRV(豬偽狂犬病毒)、SIV(豬流感病毒)、CSFV(豬瘟病毒)和豬肺炎支原體均為陰性。用ELISA 檢測(cè)PPV、PCV2 特異性抗體均為陰性。

    1.3 主要試劑和儀器

    RNAiso Plus、 PrimeScriptTMReverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;RPMI 1640 購(gòu)自Invitrogen 公司;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。LightCycler480 Realtime PCR 購(gòu)自羅氏公司,超凈臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。AIRTECH超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司,Lightcycler480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR加樣板購(gòu)自Roche 公司,Eppendor 微量移液器,倒置熒光顯微鏡(Zeiss4.7)購(gòu)自德國(guó)zeiss 公司,CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

    1.4 PAM 的分離

    選取2 頭7 周齡斷奶仔豬,無(wú)菌摘取其肺臟,用含有5%FBS 的PBS 100 ml 灌洗肺臟,2 ~5 min 后回收灌洗液,共灌洗3 次。灌洗液經(jīng)3 層紗布過(guò)濾后,1 500 r/min離心10 min,用無(wú)菌PBS 洗滌2 次,最后重懸于10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液,經(jīng)0.2%臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性在95%以上,調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ml 2 ×106個(gè),鋪至6 孔細(xì)胞板,37 ℃貼壁培養(yǎng)2 h 后棄去未貼壁的細(xì)胞,用無(wú)菌PBS 清洗細(xì)胞表面,37 ℃培養(yǎng)24 h 以備接種病毒。

    1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    將生長(zhǎng)在6 孔板上的PAMs 細(xì)胞分為4 組,分別為PPV 組、PCV2 組、PPV/PCV2 混合感染組和對(duì)照組,每組3 個(gè)重復(fù)。各組按照0.1 MOI 接種病毒,對(duì)照組接種等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液,分別于感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集細(xì)胞,凍存于-80 ℃,之后對(duì)各組細(xì)胞因子mRNA 水平進(jìn)行Realtime-PCR 檢測(cè),比較組間差異。

    1.6 PCV2、PPV 及細(xì)胞因子基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立

    按照常規(guī)方法構(gòu)建PCV2、PPV 和細(xì)胞因子基因的重組質(zhì)粒,并提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)定OD260吸光值,參照文獻(xiàn)[16]介紹的方法計(jì)算出各重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。Realtime-PCR 反應(yīng)體系:SYBR PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl,10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl,cDNA 2 μl,加超純水補(bǔ)足20 μl。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR 反應(yīng):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃5 s,60 ℃20 s,共40 個(gè)循環(huán)。

    1.7 Realtime-PCR 檢測(cè)病毒拷貝數(shù)及細(xì)胞因子mRNA 水平

    按照RNAiso 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,應(yīng)用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶,以O(shè)ligo(dT)15為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 用于檢測(cè)細(xì)胞因子。Realtime-PCR反應(yīng)體系:SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl,10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl,cDNA 2 μl,加超純水補(bǔ)足20 μl。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR 反應(yīng):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃5 s,60 ℃20 s,共40 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后得到檢測(cè)樣品中細(xì)胞因子cDNA 拷貝數(shù)。每個(gè)細(xì)胞因子的檢測(cè)樣品重復(fù)3 次。

    1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    經(jīng)Realtime-PCR 反應(yīng)后,獲得每個(gè)檢測(cè)樣品中細(xì)胞因子及管家基因拷貝數(shù),應(yīng)用2-△△Ct法對(duì)各組細(xì)胞因子進(jìn)行比較,數(shù)據(jù)用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并進(jìn)行差異分析。

    表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 The primers for realtime PCR

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCV2、PPV 及細(xì)胞因子基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋6 ~7 個(gè)梯度(1 μl 109~103),采用Realtime-PCR 擴(kuò)增,獲得PCV2、PPV 和細(xì)胞因子基因的Realtime-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程(圖1)。結(jié)果顯示,所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2>0.99,重復(fù)性好,可用于計(jì)算待測(cè)樣品的拷貝數(shù)。

    2.2 PCV2 和PPV 在PAMs 中病毒拷貝數(shù)的變化

    感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集感染細(xì)胞,應(yīng)用Realtime PCR 測(cè)定各組PAMs 中PCV2和PPV 核酸拷貝數(shù)(圖2),結(jié)果顯示,PCV2 單獨(dú)感染組與PCV2/PPV 混合感染組相比,在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中混合感染組PCV2 核酸拷貝數(shù)都高于單獨(dú)感染組。PPV 單獨(dú)感染組PPV 核酸拷貝數(shù)在24 h 比12 h 提高40%,并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束,PPV 單獨(dú)感染組與PCV2/PPV 混合感染組相比,混合感染組PPV 核酸拷貝數(shù)在48 h 后上升,并在60 h、72 h 比PPV 單獨(dú)感染組高10 倍。

    2.3 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對(duì)IFN-γ 的影響

    PCV2 與PPV 體外感染PAMs 后,收取感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后的PAMs 提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,之后進(jìn)行Realtime-PCR 檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖3。PCV2/PPV 混合感染組IFN-γ 的表達(dá)量顯著低于PCV2 或PPV 單獨(dú)感染組,并低于對(duì)照組水平。相比于對(duì)照組,PCV2 或PPV 單獨(dú)感染后能顯著促進(jìn)IFN-γ 表達(dá)量的增加,PCV2 促進(jìn)作用最大。由此說(shuō)明,PCV2 和PPV 單獨(dú)感染能激活I(lǐng)FN-γ 的表達(dá),PCV2 和PPV 混合感染可能顯著抑制IFN-γ 的表達(dá)。

    圖1 PPV、PCV2 和細(xì)胞因子部分基因Realtime-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程Fig.1 Standard curve and linear regression of realtime-PCR for PPV,PCV2 and cytokines

    圖2 PPV 和PCV2 單獨(dú)以及PPV、PCV2 混合感染病毒拷貝數(shù)Fig.2 The copy numbers of PPV,PCV2,and PPV/PCV2 coinfection

    圖3 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后IFN-γ 表達(dá)量Fig.3 The expressions of IFN-γ mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

    2.4 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對(duì)TNF-α 的影響

    Realtime-PCR 法測(cè)定各組PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后TNF-αmRNA 表達(dá)水平變化。圖4 顯示,PPV 和PCV2 單獨(dú)感染都可以引起TNF-α 的大量表達(dá),分別在48 h 和36 h 達(dá)到最高峰,之后下降;PCV2/PPV 混合感染導(dǎo)致TNF-α 的持續(xù)表達(dá)并在48h 達(dá)到最高峰,之后下降,在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程顯著高于PCV2 單獨(dú)感染組和PPV 單獨(dú)感染組。由此說(shuō)明,PCV2/PPV 混合感染促進(jìn)了TNF-α的大量表達(dá)。

    圖4 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后TNF-α mRNA 定量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The expressions of TNF-α mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

    2.5 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對(duì)IL-10 的影響

    Realtime-PCR 測(cè)定各組PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后IL-10 的mRNA 表達(dá)量變化。圖5 顯示,PPV 組與PCV2 組IL-10 表達(dá)量差異不顯著,PCV2/PPV 混合感染組IL-10 表達(dá)量在36h和48h 顯著高于PCV2 組和PPV 組,其他時(shí)間差異不顯著。

    圖5 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后IL-10 mRNA 定量檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The expressions of IL-10 mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

    3 討論

    PMWS 是由豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)造成的一種消耗性疾病,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。PPV 已被用于與PCV2 合并感染引起PMWS的模型[6,8-9,17-19],有將近15%患有PMWS 的豬存在PCV2 與PPV 的混合感染[20]。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在感染宿主的免疫反應(yīng)中占據(jù)著舉足輕重位置。肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)能夠抵抗各種病原體的感染,是肺臟初級(jí)防御中的重要細(xì)胞,同時(shí)它又是PCV2與PPV 共同的靶細(xì)胞[10-13]。本試驗(yàn)將PCV2 與PPV體外單獨(dú)、混合感染PAMs 后動(dòng)態(tài)檢測(cè)各細(xì)胞因子的變化,推測(cè)兩種病毒混合感染對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。

    本研究通過(guò)PCV2 與PPV 體外混合感染PAMs,動(dòng)態(tài)檢測(cè)PCV2 與PPV 病毒核酸含量。在感染早期,PPV 組中PPV 病毒量略高于PCV2/PPV 混合感染組,但是在感染后期,后者PPV 病毒量明顯高于前者,由此推測(cè),在混合感染中,PPV 能促進(jìn)PCV2感染PAMs,同時(shí)PCV2 能顯著促進(jìn)PPV 在PAMs 中的增殖。

    國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明,PCV2 與PPV 混合感染可以引起豬體質(zhì)量下降、黃疸、衰竭、貧血、以及全身淋巴結(jié)炎癥、腎炎、肺炎等PMWS 的典型癥狀[17,21]。PCV2 感染可使豬淋巴結(jié)、扁桃體、胸腺等局部免疫器官和免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌失衡,導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂和免疫應(yīng)答能力降低[2,14]。IFN-γ主要由抗原刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生,在機(jī)體抵抗病毒反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。劉祥義[14]等PAMs體內(nèi)試驗(yàn)研究結(jié)果表明PCV2/PPV 混合感染使PAMs 持續(xù)低水平的IFN-γ 表達(dá)。本試驗(yàn)中,PCV2/PPV 混合感染組,IFN-γ 表達(dá)量明顯減少,IFN-γ 主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,具有抗病毒能力,由此推測(cè),IFN-γ 表達(dá)量的減少增加了病毒感染機(jī)率。PCV2/PPV 混合感染組PAMs 持續(xù)較低水平的表達(dá)IFN-γ可能會(huì)導(dǎo)致IL-10 的過(guò)量表達(dá),從而導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)失衡,造成更為嚴(yán)重的病理?yè)p傷。

    TNF-α 是一種前炎性細(xì)胞因子,主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能起到抵抗細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染,阻礙病毒復(fù)制,調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)免疫的作用;是體內(nèi)熱源分子之一,它與炎癥感染后體溫升高有關(guān)。Kim[6]等證明PPV 對(duì)豬圓環(huán)病毒引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的增強(qiáng)作用與TNF-α 過(guò)量表達(dá)有關(guān)。Chang 等[22]的研究結(jié)果表明PCV2 感染的PAMs 中TNF-α 過(guò)量表達(dá)。本試驗(yàn)中,PCV2 單獨(dú)感染TNF-α 表達(dá)量明顯增加,而且PCV2/PPV 混合感染TNF-α 表達(dá)量較PCV2 單獨(dú)感染組顯著增加,由此推斷,PPV 的感染活化了PAMs,增強(qiáng)了TNF-α的表達(dá),最終導(dǎo)致體溫升高等一系列臨床表現(xiàn)。

    Darwich 等[23]的研究結(jié)果表明亞臨床PCV2 感染的豬有短暫的IL-10 過(guò)量表達(dá)。IL-10 和其他促炎癥細(xì)胞因子可能在PCV2 致病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[24-25]。IL-10 由巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、TH2 細(xì)胞分泌,能抑制巨噬細(xì)胞、抑制TH1 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和抗體生成,促進(jìn)胸腺和肥大細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)中PCV2/PPV 組短暫的IL-10表達(dá)量增加,且IFN-γ 的表達(dá)持續(xù)被抑制,由此推斷PPV 與PCV2 混合感染引起IL-10 的過(guò)量表達(dá),使肺泡巨噬細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)水平持續(xù)較低,導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)失衡,不能有效的清除PCV2 病毒,進(jìn)而導(dǎo)致更為嚴(yán)重的病理?yè)p傷。

    綜合上述分析結(jié)果推測(cè),PPV 與PCV2 混合感染抑制了肺泡巨噬細(xì)胞IFN-γ 的表達(dá),并促進(jìn)了TNF-α 的表達(dá)及短暫的IL-10 的表達(dá),導(dǎo)致感染早期機(jī)體抗病毒能力降低,引起機(jī)體免疫抑制,進(jìn)而引起感染免疫系統(tǒng)紊亂,影響特異性免疫動(dòng)能的正常運(yùn)轉(zhuǎn),為PMWS 的發(fā)病創(chuàng)造了前提條件。

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