PCV2 與PPV 體外混合感染豬肺泡巨噬細(xì)胞對細(xì)胞因子的影響

王永帥，唐 波， 張雪花， 華 濤， 常 晨， 劉國洋， 侯繼波， 張道華，

楊德吉1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為已知的最小的動物病毒，是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的必須病原，是危害當(dāng)今全球養(yǎng)豬業(yè)最主要的免疫抑制性疾病之一［1-3］。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)是PCVAD 的一種重要的表現(xiàn)形式，嚴(yán)重影響仔豬斷奶后的生長發(fā)育［4］。無論在臨床或?qū)嶒?yàn)條件下，單獨(dú)的PCV2 感染很難誘發(fā)PMWS，在臨床條件下PCV2 與豬細(xì)小病毒(PPV)混合感染可以顯著提高PMWS 發(fā)病率［5-7］，另外在試驗(yàn)條件下PPV 已被廣泛應(yīng)用于PMWS 的發(fā)病模型［6，8-9］。PCV2 與PPV 共同的靶細(xì)胞豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)［10-13］是豬體先天性免疫的第一道防線［14］，當(dāng)PAMs 感染PCV2 或與PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)混合感染后可以增強(qiáng)IL-10 或TNF-α 等免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的作用，導(dǎo)致免疫抑制或?qū)ωi體先天性免疫產(chǎn)生損傷［15］。PPV 同樣可感染PAMs，而關(guān)于PCV2 與PPV 共同感染PAMs 并對其細(xì)胞因子影響的研究較少。本研究通過PCV2 和PPV 混合感染體外豬肺泡巨噬細(xì)胞，測定兩種病毒在該細(xì)胞中的增殖規(guī)律及不同細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)水平，以闡明PMWS 發(fā)病機(jī)理，為有效預(yù)防和治療該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

PCV2 病毒NJ 株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，其TCID50為1 ml 105.6。PPV 病毒NJ 株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，其TCID50為1 ml 107。

1.2 試驗(yàn)動物

7 周齡斷奶仔豬，經(jīng)PCR 或RT-PCR 檢測PRRSV、PCV2、PPV、PRV(豬偽狂犬病毒)、SIV(豬流感病毒)、CSFV(豬瘟病毒)和豬肺炎支原體均為陰性。用ELISA 檢測PPV、PCV2 特異性抗體均為陰性。

1.3 主要試劑和儀器

RNAiso Plus、 PrimeScriptTMReverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司;RPMI 1640 購自Invitrogen 公司;胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。LightCycler480 Realtime PCR 購自羅氏公司，超凈臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。AIRTECH超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，Lightcycler480 實(shí)時熒光定量PCR 儀和實(shí)時熒光定量PCR加樣板購自Roche 公司，Eppendor 微量移液器，倒置熒光顯微鏡(Zeiss4.7)購自德國zeiss 公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司。

1.4 PAM 的分離

選取2 頭7 周齡斷奶仔豬，無菌摘取其肺臟，用含有5%FBS 的PBS 100 ml 灌洗肺臟，2 ～5 min 后回收灌洗液，共灌洗3 次。灌洗液經(jīng)3 層紗布過濾后，1 500 r/min離心10 min，用無菌PBS 洗滌2 次，最后重懸于10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，經(jīng)0.2%臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活性在95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ml 2 ×106個，鋪至6 孔細(xì)胞板，37 ℃貼壁培養(yǎng)2 h 后棄去未貼壁的細(xì)胞，用無菌PBS 清洗細(xì)胞表面，37 ℃培養(yǎng)24 h 以備接種病毒。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計

將生長在6 孔板上的PAMs 細(xì)胞分為4 組，分別為PPV 組、PCV2 組、PPV/PCV2 混合感染組和對照組，每組3 個重復(fù)。各組按照0.1 MOI 接種病毒，對照組接種等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別于感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集細(xì)胞，凍存于-80 ℃，之后對各組細(xì)胞因子mRNA 水平進(jìn)行Realtime-PCR 檢測，比較組間差異。

1.6 PCV2、PPV 及細(xì)胞因子基因?qū)崟r熒光定量PCR 檢測方法的建立

按照常規(guī)方法構(gòu)建PCV2、PPV 和細(xì)胞因子基因的重組質(zhì)粒，并提取陽性重組質(zhì)粒測定OD260吸光值，參照文獻(xiàn)［16］介紹的方法計算出各重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。Realtime-PCR 反應(yīng)體系:SYBR PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl，10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl，cDNA 2 μl，加超純水補(bǔ)足20 μl。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR 反應(yīng):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 個循環(huán)。

1.7 Realtime-PCR 檢測病毒拷貝數(shù)及細(xì)胞因子mRNA 水平

按照RNAiso 試劑盒說明書提取總RNA，應(yīng)用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶，以O(shè)ligo(dT)15為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 用于檢測細(xì)胞因子。Realtime-PCR反應(yīng)體系:SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl，10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl，cDNA 2 μl，加超純水補(bǔ)足20 μl。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR 反應(yīng):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后得到檢測樣品中細(xì)胞因子cDNA 拷貝數(shù)。每個細(xì)胞因子的檢測樣品重復(fù)3 次。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

經(jīng)Realtime-PCR 反應(yīng)后，獲得每個檢測樣品中細(xì)胞因子及管家基因拷貝數(shù)，應(yīng)用2-△△Ct法對各組細(xì)胞因子進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并進(jìn)行差異分析。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物Table 1 The primers for realtime PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2、PPV 及細(xì)胞因子基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋6 ～7 個梯度(1 μl 109～103)，采用Realtime-PCR 擴(kuò)增，獲得PCV2、PPV 和細(xì)胞因子基因的Realtime-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程(圖1)。結(jié)果顯示，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，重復(fù)性好，可用于計算待測樣品的拷貝數(shù)。

2.2 PCV2 和PPV 在PAMs 中病毒拷貝數(shù)的變化

感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集感染細(xì)胞，應(yīng)用Realtime PCR 測定各組PAMs 中PCV2和PPV 核酸拷貝數(shù)(圖2)，結(jié)果顯示，PCV2 單獨(dú)感染組與PCV2/PPV 混合感染組相比，在整個試驗(yàn)過程中混合感染組PCV2 核酸拷貝數(shù)都高于單獨(dú)感染組。PPV 單獨(dú)感染組PPV 核酸拷貝數(shù)在24 h 比12 h 提高40%，并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，PPV 單獨(dú)感染組與PCV2/PPV 混合感染組相比，混合感染組PPV 核酸拷貝數(shù)在48 h 后上升，并在60 h、72 h 比PPV 單獨(dú)感染組高10 倍。

2.3 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對IFN-γ 的影響

PCV2 與PPV 體外感染PAMs 后，收取感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后的PAMs 提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后進(jìn)行Realtime-PCR 檢測，檢測結(jié)果如圖3。PCV2/PPV 混合感染組IFN-γ 的表達(dá)量顯著低于PCV2 或PPV 單獨(dú)感染組，并低于對照組水平。相比于對照組，PCV2 或PPV 單獨(dú)感染后能顯著促進(jìn)IFN-γ 表達(dá)量的增加，PCV2 促進(jìn)作用最大。由此說明，PCV2 和PPV 單獨(dú)感染能激活I(lǐng)FN-γ 的表達(dá)，PCV2 和PPV 混合感染可能顯著抑制IFN-γ 的表達(dá)。

圖1 PPV、PCV2 和細(xì)胞因子部分基因Realtime-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程Fig.1 Standard curve and linear regression of realtime-PCR for PPV，PCV2 and cytokines

圖2 PPV 和PCV2 單獨(dú)以及PPV、PCV2 混合感染病毒拷貝數(shù)Fig.2 The copy numbers of PPV，PCV2，and PPV/PCV2 coinfection

圖3 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后IFN-γ 表達(dá)量Fig.3 The expressions of IFN-γ mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

2.4 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對TNF-α 的影響

Realtime-PCR 法測定各組PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后TNF-αmRNA 表達(dá)水平變化。圖4 顯示，PPV 和PCV2 單獨(dú)感染都可以引起TNF-α 的大量表達(dá)，分別在48 h 和36 h 達(dá)到最高峰，之后下降;PCV2/PPV 混合感染導(dǎo)致TNF-α 的持續(xù)表達(dá)并在48h 達(dá)到最高峰，之后下降，在整個試驗(yàn)過程顯著高于PCV2 單獨(dú)感染組和PPV 單獨(dú)感染組。由此說明，PCV2/PPV 混合感染促進(jìn)了TNF-α的大量表達(dá)。

圖4 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后TNF-α mRNA 定量檢測結(jié)果Fig.4 The expressions of TNF-α mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

2.5 PCV2 和PPV 體外感染PAMs 對IL-10 的影響

Realtime-PCR 測定各組PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后IL-10 的mRNA 表達(dá)量變化。圖5 顯示，PPV 組與PCV2 組IL-10 表達(dá)量差異不顯著，PCV2/PPV 混合感染組IL-10 表達(dá)量在36h和48h 顯著高于PCV2 組和PPV 組，其他時間差異不顯著。

圖5 PAMs 受PCV2 和PPV 體外感染后IL-10 mRNA 定量檢測結(jié)果Fig.5 The expressions of IL-10 mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

3 討論

PMWS 是由豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)造成的一種消耗性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［6］。PPV 已被用于與PCV2 合并感染引起PMWS的模型［6，8-9，17-19］，有將近15%患有PMWS 的豬存在PCV2 與PPV 的混合感染［20］。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在感染宿主的免疫反應(yīng)中占據(jù)著舉足輕重位置。肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)能夠抵抗各種病原體的感染，是肺臟初級防御中的重要細(xì)胞，同時它又是PCV2與PPV 共同的靶細(xì)胞［10-13］。本試驗(yàn)將PCV2 與PPV體外單獨(dú)、混合感染PAMs 后動態(tài)檢測各細(xì)胞因子的變化，推測兩種病毒混合感染對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。

本研究通過PCV2 與PPV 體外混合感染PAMs，動態(tài)檢測PCV2 與PPV 病毒核酸含量。在感染早期，PPV 組中PPV 病毒量略高于PCV2/PPV 混合感染組，但是在感染后期，后者PPV 病毒量明顯高于前者，由此推測，在混合感染中，PPV 能促進(jìn)PCV2感染PAMs，同時PCV2 能顯著促進(jìn)PPV 在PAMs 中的增殖。

國內(nèi)外研究結(jié)果表明，PCV2 與PPV 混合感染可以引起豬體質(zhì)量下降、黃疸、衰竭、貧血、以及全身淋巴結(jié)炎癥、腎炎、肺炎等PMWS 的典型癥狀［17，21］。PCV2 感染可使豬淋巴結(jié)、扁桃體、胸腺等局部免疫器官和免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌失衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂和免疫應(yīng)答能力降低［2，14］。IFN-γ主要由抗原刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體抵抗病毒反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。劉祥義［14］等PAMs體內(nèi)試驗(yàn)研究結(jié)果表明PCV2/PPV 混合感染使PAMs 持續(xù)低水平的IFN-γ 表達(dá)。本試驗(yàn)中，PCV2/PPV 混合感染組，IFN-γ 表達(dá)量明顯減少，IFN-γ 主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，具有抗病毒能力，由此推測，IFN-γ 表達(dá)量的減少增加了病毒感染機(jī)率。PCV2/PPV 混合感染組PAMs 持續(xù)較低水平的表達(dá)IFN-γ可能會導(dǎo)致IL-10 的過量表達(dá)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)失衡，造成更為嚴(yán)重的病理損傷。

TNF-α 是一種前炎性細(xì)胞因子，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能起到抵抗細(xì)菌或寄生蟲感染，阻礙病毒復(fù)制，調(diào)控細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)免疫的作用;是體內(nèi)熱源分子之一，它與炎癥感染后體溫升高有關(guān)。Kim［6］等證明PPV 對豬圓環(huán)病毒引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的增強(qiáng)作用與TNF-α 過量表達(dá)有關(guān)。Chang 等［22］的研究結(jié)果表明PCV2 感染的PAMs 中TNF-α 過量表達(dá)。本試驗(yàn)中，PCV2 單獨(dú)感染TNF-α 表達(dá)量明顯增加，而且PCV2/PPV 混合感染TNF-α 表達(dá)量較PCV2 單獨(dú)感染組顯著增加，由此推斷，PPV 的感染活化了PAMs，增強(qiáng)了TNF-α的表達(dá)，最終導(dǎo)致體溫升高等一系列臨床表現(xiàn)。

Darwich 等［23］的研究結(jié)果表明亞臨床PCV2 感染的豬有短暫的IL-10 過量表達(dá)。IL-10 和其他促炎癥細(xì)胞因子可能在PCV2 致病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［24-25］。IL-10 由巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、TH2 細(xì)胞分泌，能抑制巨噬細(xì)胞、抑制TH1 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和抗體生成，促進(jìn)胸腺和肥大細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)中PCV2/PPV 組短暫的IL-10表達(dá)量增加，且IFN-γ 的表達(dá)持續(xù)被抑制，由此推斷PPV 與PCV2 混合感染引起IL-10 的過量表達(dá)，使肺泡巨噬細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)水平持續(xù)較低，導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)失衡，不能有效的清除PCV2 病毒，進(jìn)而導(dǎo)致更為嚴(yán)重的病理損傷。

綜合上述分析結(jié)果推測，PPV 與PCV2 混合感染抑制了肺泡巨噬細(xì)胞IFN-γ 的表達(dá)，并促進(jìn)了TNF-α 的表達(dá)及短暫的IL-10 的表達(dá)，導(dǎo)致感染早期機(jī)體抗病毒能力降低，引起機(jī)體免疫抑制，進(jìn)而引起感染免疫系統(tǒng)紊亂，影響特異性免疫動能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，為PMWS 的發(fā)病創(chuàng)造了前提條件。

［1］ TODD D，BIAGINI P，BENDINELLI M，et al.Circoviridae［C］//Fauquet C M，Mayo M A，Maniloff J，et al.Virus taxonomy，VIIIth report of the international committee for the taxonomy of viruses.London:Elsevier/Academic Press，2005:327-334.

［2］ MENG X J.Porcine Circovirus Type 2(PCV2):Pathogenesis and Interaction with the Immune System［J］.Annu Rev Anim Biosci，2013，1:43-64.

［3］ 郭廣富，曹軍平，吳艷濤，等.江蘇泰州地區(qū)豬圓環(huán)病毒2 型感染情況調(diào)查［1］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(10):188-189.

［4］ CHAE C.Postweaning multisystemic wasting syndrome:a review of aetiology，diagnosis and pathology［J］.Vet，2004，168:41-49.

［5］ RINKU S，SAIKUMARG.Porcine parvovirus and porcine circovirus 2-associated reproductive failure and neonatal mortality in crossbred Indian pigs［J］.Trop Anim Health Prod，2010，42:515-522.

［6］ KIM J，HA Y，CHAE C.Potentiation of porcine circovirus 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome by porcine parvovirus is associated with excessive production of tumor necrosis factor-α［J］.Vet Pathol，2006，43:718.

［7］ KRAKOWKA S，ELLIS J A，MEEHAN B，et al.Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus viral wasting syndrome of swine［J］.Vet Pathol，2000，37:254.

［8］ KENNEDY S，MOFFETT D，MCNEILLY F，et al.Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus［J］.J Comp Pathol，2000，122:9-24.

［9］ KRAKOWKA S，ELLIS J A，MEEHAN B，et al.Viral wasting syndrome of swine:experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus［J］.Vet Pathol，2000，37:254-263.

［10］ GILPIN D F，MCCULLOUGH K，MEEHAN B M，et al.In vitrostudies on the infection and replication of porcine circovirus type 2 in cells of the porcine immune system［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2003，94:149-161.

［11］ ROAAELL C，BALASCH M，KENNEDY S，et al.Pathological，immunohistochemical and in-situ hybridization studies of natural cases of post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)in pigs［J］.Journal of Comparative Pathology，2010，120:59-78.

［12］ CHOI C，CHAE C.Distribution of porcine parvovirus in porcine circovirus 2-infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by insitu hybridization［J］.J Comp Pathol，2000，123:302-305.

［13］ KIM J，CHOI C，CHAE C.Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome repro-duced by co-infection with Korean isolates of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus［J］.J Comp Pathol，2003，128:52-59.

［14］ 劉祥義，陳立功，宋勤葉，等.豬圓環(huán)病毒2 型與豬細(xì)小病毒共感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能及其干擾素表達(dá)水平的影響［J］.微生物學(xué)報，2011，51(1):105-114.

［15］ FAN PEIHU，WEI YANWU，GUO LONGJUN，et al.Synergistic effects of sequential infection with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2［J］.Virology Journal，2013，10:265.

［16］ RAYMOND C R，WILKIE B N.Th-1/Th-2 type cytokine profiles of pig T-cells cultured with antigen treated monocyte derived dendritic cells［J］.Vaccine，2004，22:1016-1023.

［17］ ALLAN G M，KENNEDY S，MCNEILLY F，et al.Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus［J］.J Comp Pathol，1999，121:1-11.

［18］ ELLIS J，KRAKOWKA S，LAIRMORE M，et al.Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets［J］.J Vet Diagn Invest，1999，11:3-14.

［19］ KENNEDY S，MOFFETT D，MCNEILLY F，et al.Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus［J］.J Comp Pathol，2000，122:9-24.

［20］ ELLIS J A，BRATANICH A，CLARK E G，et al.Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaningmultisystemic wasting syndrome［J］.Vet Diagn Invest，2000，12:21-27.

［21］ ELLIS J，CLARK E，HAINES D，et al.Porcine circovirus-2 and concurrentinfections in the field［J］.Veterinary Microbiolog，2004，98(2):159-63.

［22］ CHANG H W，JENG C R，LIN T L ，et al.Immunopathological effects of porcine circovirus type 2 (PCV2)on swine alveolar macrophages by in vitro inoculation［J］.Vet Immunol Immunopathol，2006，110:207-19.

［23］ DARWICH L，SEGALéS J，RESENDES A，et al.Transient correlation between viremia levels and IL-10 expression in pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2 (PCV2)［J］.Res Vet Sci，2008，84:194-198.

［24］ RAMAMOORTHY S，MENG X J.Porcine circoviruses:a minuscule yet mammoth paradox［J］.Anim Health Res Rev，2009，10:1-20.

［25］ DARWICH L，MATEU E.Immunology of porcine circovirus type 2 (PCV2)［J］.Virus Res，2012，164:61-67.