水稻OsKAT2 基因的克隆及表達(dá)分析

高 南， 李俊林，2， 郝東利

(1.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210008;2.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京210037)

水稻生產(chǎn)過(guò)程中時(shí)常遇到季節(jié)性和區(qū)域性的干旱、高鹽等非生物逆境脅迫，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］。轉(zhuǎn)基因是提高水稻抗非生物逆境能力的主要技術(shù)措施之一［1］。篩選合適的基因，是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻培育的前提。Shaker家族K+通道成員在植物體內(nèi)的增強(qiáng)表達(dá)能提高植物的抗逆性，例如將水稻的K+通道基因OsKAT1轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的抗鹽脅迫能力明顯提高［4-5］。因此，Shaker家族K+通道成員是重要的候選基因。Shaker家族成員具有各自獨(dú)立的 表 達(dá) 模 式［6-8］。擬 南 芥［Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.］的KAT1基因在葉保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，KAT2基因在葉保衛(wèi)細(xì)胞、葉韌皮部和花中表達(dá)［6］;玉米(Zea maysL.)的ZMK2.1基因和煙草(Nicotiana tabacumL.)的NKT6基因主要在葉中表達(dá)［7-8］。與無(wú)NaCl 脅迫的處理相比，NaCl 脅迫處理強(qiáng)烈抑制了擬南芥根中AKT1的表達(dá)量，但是沒(méi)有改變地上部AKT1的表達(dá)量和擬南芥AKT2和SKOR的表達(dá)量［9］。在干旱脅迫下，煙草(Nicotiana tabacumL.)葉中NKT6的表達(dá)量低于對(duì)照［8］。在外源ABA 的脅迫下，KAT1、KAT2和NKT6在葉中的表達(dá)量降低［8，10］。水稻基因組測(cè)序已經(jīng)完成，其K+通道的研究較少［4-5，11-12］。水稻生長(zhǎng)在水中，可能具有其他旱地植物不具有的特性。因此，挖掘水稻自身的基因，研究其在脅迫下的響應(yīng)特征，對(duì)進(jìn)行水稻抗逆改良有重要意義。本研究通過(guò)電子克隆、生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR， RTqPCR)分析的方法，克隆水稻抵抗逆境脅迫的相關(guān)基因并進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻(Orazy sativaL.cv Nipponbare)種子由中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤-植物營(yíng)養(yǎng)與肥料室保存。Trizol RNA 提取試劑盒(RNAisoTMPlus)、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、DNase I、TaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α、pMD-18T 載體、質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶和熒光定量PCR 用試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司(TaKaRa Co.Ltd.，Dalian，China)。胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司(Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，England)。脫落酸(ABA)、甘露醇(Mannitol)和聚乙二醇-6000(PEG-6000)購(gòu)自Sigma 公司(Sigma-Aldrich Co.LLC.，St.Louis，USA)。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)中Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)注冊(cè)的蛋白質(zhì)序列:擬南芥的AKT1(NP_180233.1)、KAT1(NP_199436.1)、KAT2(NP_193563.3)、AKT2/3(NP_567651.1)、AtKC1(P92960.1)KAT3(NP_194991.1)、AKT5(NP_194976.1)、AKT6(NP_180131.3)、GORK(NP_198566.2)、SKOR(NP_186934.1)、KCO1(Q8LBL1.2)、KCO2(CAB64717.1)、KCO3(CAB40380.1)、KCO4(Q9FWX6.2)、KCO5(CAB62162.1)和KCO6(AEE84005.1);玉米的KZM1(NP_001105240.1)、KZM2 (NP _ 001105161.1)和 ZMK2.1 (NP _001105240.1);煙草的NKT1(BAD81034.1)、NKT2(BAD81033.1)、NKT2 (BAD81033.1)、NKT3(ACI45550.2)和NKT5(ACJ05642.2);普通小麥(Triticum aestivumL.)的TaAKT1(AAF36832.1);雨樹(shù)［Samanea saman(Jacq.) Merr.］的 SPICK1(AAD16278.1)和SPICK2(AAD39492.1);胡蘿卜(Daucus carotaL.)的KDC1(CAB62555.1);水稻的OsKAT1(NP_001044290.1)。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗培養(yǎng)和處理 水稻種子用自來(lái)水洗凈，置于1%(質(zhì)量體積比)的NaClO 溶液中劇烈振蕩20 min，再用蒸餾水清洗6 ～8 次，最后在蒸餾水中吸脹24 h。將表面滅菌的水稻種子均勻鋪在尼龍網(wǎng)上，放到人工氣候箱中黑暗條件下萌發(fā)3 d，每天更換蒸餾水。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)到改良的木村營(yíng)養(yǎng)液［13］中，繼續(xù)在人工氣候箱中生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件條件:光照16 h，黑暗8 h，溫度為28 ℃，相對(duì)濕度為70%。改良后的木村營(yíng)養(yǎng)液配方為0.36 mmol/L KCl，0.36 mmol/L (NH4)2SO4，0.18 mmol/L NaH2PO4，0.55 mmol/L MgSO4，0.36 mmol/L Ca(NO3)2，0.18 mmol/L NaNO3，0.50 μmol/L H2SiO3，30.00 μmol/L Na2Fe-EDTA，46.26 μmol/L H3BO3，9.15 μmol/L MnCl2，0.76 μmol/L ZnSO4，0.32 μmol/L CuSO4，0.32 μmol/L Na2MoO4，pH5.6。營(yíng)養(yǎng)液每3 d 更換一次。選取長(zhǎng)勢(shì)一致健壯的14 d苗齡水稻幼苗，移至改良后的木村營(yíng)養(yǎng)液中(對(duì)照)及分別含100 mmol/L NaCl、10 % (質(zhì)量體積比)PEG-6000 和20 μmol/L ABA 的上述改良木村營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行脅迫處理。處理3 h、6 h、24 h 和48 h 后，收獲地上部或根部，迅速放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 水稻總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成

取凍存的水稻樣品，液氮中研磨成細(xì)末，取約100 mg 細(xì)末加入1 ml Trizol，然后按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行抽提。為除去基因組DNA 污染，得到的RNA 采用DNase I 于37 ℃酶解30 min，氯仿抽提，100 %乙醇沉淀。得到的沉淀用70 %乙醇洗滌后晾干，溶解于40 μl DEPC(焦炭酸二乙酯)水中。RNA 經(jīng)電泳檢測(cè)、紫外檢測(cè)合格后，按說(shuō)明書(shū)操作步驟用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3OsKAT2基因cDNA 序列的獲得 在水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(Rice genome annotation project，RGAP)中，以擬南芥KAT1基因蛋白質(zhì)序列為查詢探針，進(jìn)行BlastP 比對(duì)(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml)，得到1 條可能的鉀離子通道序列(LOC_Os01g11250)。根據(jù)其CDS 兩端序列，設(shè)計(jì)上游引物F1 (5'-ATGGCAGCTAGAAGCGAGCTTCTC-3')和下游引物R1(5'-CTAAAGATGACCGCTGACAAAAGCC-3')。 以地上部cDNA 為模板，進(jìn)行50 μl 體系的PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:第一步，94 ℃變性5 min;第二步，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，重復(fù)35 個(gè)循環(huán);第三步，72 ℃延伸7 min。得到的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段并連接到pMD18 克隆載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并送寶生物(大連)有限公司(TaKaRa Co.Ltd.，Dalian，China)測(cè)序。

1.2.4OsKAT2基因的生物信息學(xué)分析 用DNAMAN8.0 分析測(cè)序得到的cDNA 開(kāi)放閱讀框并推測(cè)其編碼的氨基酸序列。用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析Os-KAT2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在 線分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)。使用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)在線分析親水性/疏水性預(yù)測(cè)。使用WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)在線分析蛋白質(zhì)序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。使用MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)和CCD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在 線 分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。使用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)。使用SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白質(zhì)信號(hào)序列。使用SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page = npsa_sopma.html)在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id =index)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA6.05 軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)分析OsKAT2在水稻不同部位(根部和地上部)和不同脅迫處理下的表達(dá)水平，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。目的基因所用上游引物為F3(5'-GAAAACAGCGATGACAGACGAGT-3')，下游引物為R3(5'-AAGCCATAGAATGACCATTATTAGC-3')。 用看家基因OsActin基因作為內(nèi)標(biāo)，上游引物為Os-ActinF464(5'-CATGTTTGAGACCTTCAACACCCCTGCTA-3')，下 游 引 物 為 OsActinR933 (5'-ATGTAGTCTCATGGATACCCGCAGCTT-3')。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(TaKaRa SYBR? PremixEx TaqTM)操作和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 OsKAT2 基因的獲得和序列分析

2.1.1 cDNA 序列分析 利用引物F1 和R1 進(jìn)行cDNA 編碼區(qū)序列的RT-PCR 擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果顯示，OsKAT2基因的ORF 區(qū)為1 806 bp。推導(dǎo)可知Os-KAT2 蛋白質(zhì)含601 個(gè)氨基酸殘基。除比RGAP 中推測(cè)的ORF 序列(1 707 bp)多104 bp(圖1)外，其余堿基兩者相同。

2.1.2 OsKAT2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 用Prot-Param 軟件分析，OsKAT2 蛋白質(zhì)中含量較高的氨基酸殘基包括亮氨酸殘基(11.6%)、異亮氨酸殘基(8.2%)和精氨酸殘基(6.5%)，含量較低的有色氨酸殘基(1.7%)、組氨酸殘基(2.5%)和蛋氨酸殘基(2.5%)等。帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基為61 個(gè)，帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸)殘基為68 個(gè)。OsKAT2 蛋白質(zhì)共有9 854個(gè)原子，分子量為6 980 639，蛋白質(zhì)的分子式為C3164H4938N846O876S30，理論等電點(diǎn)為8.57。在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中的半衰期分別為30 h(體外)、＞20 h(體內(nèi))和＞10 h(體內(nèi));該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為37.22，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.1.3 OsKAT2 蛋白質(zhì)的親水性/疏水性和亞細(xì)胞定位 用ProtScale 預(yù)測(cè)OsKAT2 蛋白質(zhì)親水性/疏水性。結(jié)果(圖2)顯示，氨基酸的最低分值為-3.011，最高分值為2.756。從整體來(lái)看，親水氨基酸殘基分布在整條肽鏈，且多于疏水性氨基酸殘基。使用TMHMM 進(jìn)行預(yù)測(cè)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，OsKAT2 蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)。WolfPsort 預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)可能在細(xì)胞質(zhì)膜上。

圖1 水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(RGAP)中推測(cè)的OsKAT2 序列與RT-PCR 獲得的OsKAT2 序列比對(duì)Fig.1 Alignment of OsKAT2 sequences achieved by rice genome annotation and RT-PCR

圖2 OsAKT2 蛋白質(zhì)的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of hydrophilicity /hydrophobicity of protein OsKAT2

2.1.4 OsKAT2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)用MotifScan 和CCD 預(yù)測(cè)OsKAT2 蛋白質(zhì)序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)可能存在的翻譯后修飾位點(diǎn)包括4 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶II位點(diǎn)、6個(gè)N-?；稽c(diǎn)和7 個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn);發(fā)現(xiàn)有5 種結(jié)構(gòu)域(圖3)，分別是環(huán)腺苷一磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Crp，CO G0664)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(Ion_trans_2，pfam07885)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(Ion_trans，pfam00520)、未知功能的DUF3354 超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域(DUF3354，pfam11834)和環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CAP_ED，cd00038)。該蛋白質(zhì)具有Shaker基因家族的典型特征，即在蛋白質(zhì)的N 末端包括6 個(gè)跨膜區(qū)(S1 ～S6)，有電壓感受區(qū)和高度保守的通道孔區(qū)。用磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)程序NetPhos 2.0 進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)OsKAT2 有15 個(gè)潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)潛在的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和4 個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。利用SignalP 4.1 Server 在線分析Os-KAT2 蛋白質(zhì)信號(hào)肽情況，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)不含信號(hào)肽序列。推測(cè)OsKAT2 屬于Shaker家族，可能具有吸收K+的功能。

圖3 OsKAT2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of conserved domain of protein OsKAT2

2.1.5 OsKAT2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)OsKAT2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，OsKAT2 蛋白質(zhì)由54.08% 的α-螺旋、15.64%的折疊延伸、3.3%的β-轉(zhuǎn)角和26.96%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。折疊延伸和的β-轉(zhuǎn)角不均勻地分布在整個(gè)蛋白質(zhì)的多肽鏈上。依據(jù)模板c2ptmA，采用折疊識(shí)別法用Phyer 在線軟件預(yù)測(cè)OsKAT2 蛋白質(zhì)序列主鏈原子位置生成預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖4)，最后依據(jù)能量最小化原理使側(cè)鏈集團(tuán)處于能量最小的位置。

圖4 預(yù)測(cè)的OsKAT2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Prediction of 3D structure of protein OsKAT2

2.1.6OsKAT2編碼基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析 搜索與水稻K+通道蛋白質(zhì)OsKAT2 同源的擬南芥及相關(guān)植物蛋白質(zhì)序列，運(yùn)用MEGA6.05 軟件繪制構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖5)顯示，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可分為6 組，其中I、II、III、IV、V 組為Shaker家族的K+通道蛋白質(zhì)，第VI 組為KCO 家族的K+通道蛋白質(zhì)，OsKAT2 位于第II 組中。從圖5 可以看出，水稻OsKAT2 在進(jìn)化上與單子葉植物玉米的KZM2 和ZMK2.1 的進(jìn)化關(guān)系最近。可以推測(cè)，OsKAT2 可能是Shaker家族的內(nèi)向整流蛋白質(zhì)。

圖5 部分植物鉀離子通道的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of potassium channels of some plants

2.2 OsKAT2 基因的表達(dá)特點(diǎn)

采用RT-qPCR 對(duì)水稻OsKAT2基因在非脅迫下的表達(dá)部位進(jìn)行分析。結(jié)果(圖6)表明，OsKAT2基因地上部的表達(dá)量比根的表達(dá)量多近10 倍。因此，在分析干旱、高鹽和ABA 脅迫對(duì)水稻OsKAT2基因表達(dá)的影響時(shí)，以地上部為研究部位。由圖7 可見(jiàn)，在正常對(duì)照條件下，水稻地上部OsKAT2基因有表達(dá)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)的豐度也有增減。在PEG 模擬干旱、NaCl 模擬高鹽和ABA 的脅迫下，水稻地上部OsKAT2基因表達(dá)量明顯下調(diào)，且不同處理響應(yīng)的程度不同。在PEG-6000 處理3 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量明顯降低;當(dāng)處理24 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量降低最大，可達(dá)68.6%;當(dāng)處理48 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量降低略有下降，仍然可以達(dá)到36.2%。在NaCl 處理6 h 時(shí)，水稻地上部Os-KAT2基因相對(duì)表達(dá)量減少62.9%;當(dāng)處理24 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量降低最大，可達(dá)72.7%%;當(dāng)處理48 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量降低達(dá)到61.2%。在ABA 處理3 h時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量減少68.4%;當(dāng)處理6 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量的降低最大，可達(dá)73.3%;當(dāng)處理24 h 時(shí)，水稻地上部OsKAT2基因相對(duì)表達(dá)量降低略有減少。總體上，水稻地上部OsKAT2基因在ABA 脅迫時(shí)下調(diào)表達(dá)最明顯。

圖6 OsKAT2 基因在水稻不同器官中的表達(dá)Fig.6 Expression levels of OsKAT2 in different organs of rice

圖7 水稻地上部OsKAT2 基因在非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.7 Inducible expression of OsKAT2 in rice shoot under abiotic stresses

3 討論

同源克隆在獲得植物新基因中有廣泛的應(yīng)用［8，14-15］。本研究通過(guò)電子克隆的方法，獲得了一個(gè)可能的K+通道基因。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法和工具對(duì)OsKAT2基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)OsKAT2 蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)，α-螺旋和折疊延伸是主要的構(gòu)成原件，這些與大多數(shù)KAT1 類K+通道蛋白質(zhì)的特征是一致的。OsKAT2 蛋白質(zhì)含離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(pfam07885 和pfam00520)，功能分析結(jié)果說(shuō)明該蛋白質(zhì)屬于陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。OsKAT2 蛋白質(zhì)與KZM2 和ZMK2.1 的同源性較高，含K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD［8，16-17］。OsKAT2 不存在錨定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，這與大部分Shaker家族第II 組成員在C-末端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上存在一致性，說(shuō)明OsKAT2 可能不參與通道蛋白質(zhì)亞基的異聚化作用，而在與其他蛋白質(zhì)的互作或細(xì)胞膜錨定的過(guò)程中發(fā)揮作用［17］。上述結(jié)果說(shuō)明OsKAT2基因是一個(gè)K+通道基因。然而，來(lái)源不同的同源通道往往有其獨(dú)特之處［7］。水稻長(zhǎng)期生長(zhǎng)在淹水環(huán)境中，其K+通道在長(zhǎng)期適應(yīng)物種生境的進(jìn)化過(guò)程中，可能形成了有別于擬南芥和玉米等旱生植物的獨(dú)特功能特征和作用機(jī)制［12］。OsKAT2的功能還需要進(jìn)一步研究。

植物在適應(yīng)非生物逆境脅迫過(guò)程中，許多基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，由此導(dǎo)致體內(nèi)一些生物化學(xué)與生物物理過(guò)程的適應(yīng)性調(diào)整，如離子含量的增加，脯氨酸的積累等，進(jìn)而抗非生物逆境的能力增強(qiáng)［4-5］。其中，部分響應(yīng)非生物逆境脅迫的基因能提高作物抵抗非生物逆境脅迫的能力。在本研究中，利用RT-qPCR 測(cè)定了OsKAT2在模擬干旱(PEG 處理)、高鹽和外源ABA 脅迫下表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，OsKAT2主要在地上部表達(dá)，受模擬干旱、高鹽和外源ABA 脅迫誘導(dǎo)下調(diào)。ZMK2.1、KAT2等基因與OsKAT2高度同源，基因的表達(dá)部位主要在地上部［6-7］，與本研究的結(jié)果一致。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)第II組的KAT1、KAT2和NKT6基因，在ABA 等逆境條件下，葉片中的表達(dá)量降低［6，8，10］，這與本研究中Os-KAT2在脅迫時(shí)的表達(dá)特征基本一致。ZMK2.1、KAT2、KAT1、KAT2和NKT6等基因均參與保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，在植物抵抗非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用［6-8，10］。因此，推測(cè)OsKAT2可能在水稻抵抗逆境脅迫中發(fā)揮作用，是一個(gè)能通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻抗非生物逆境能力的候選基因。除轉(zhuǎn)錄水平外，OsKAT2 蛋白質(zhì)存在翻譯后修飾位點(diǎn)，即OsKAT2 與大多數(shù)Shaker家族K+通道一樣也存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。對(duì)OsKAT2 在干旱、高鹽和ABA 等逆境脅迫下的蛋白質(zhì)水平調(diào)控還需要進(jìn)一步研究。

本研究獲得了一個(gè)Shaker家族K+通道基因OsKAT2。該基因編碼產(chǎn)物OsKAT2 由601 個(gè)氨基酸組成，包含K+通道的保守結(jié)構(gòu)域，屬于Shaker家族第II 組。OsKAT2的mRNA 在水稻地上部大量表達(dá);干旱、高鹽和外源ABA 脅迫處理誘導(dǎo)OsKAT2的表達(dá)量下調(diào)。初步推測(cè)OsKAT2可能在水稻抵抗逆境脅迫中發(fā)揮作用，是一個(gè)水稻抗非生物逆境改良的候選基因。

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