曲秦,李宗霖,麻紀(jì)斌,陳雁,翟帆
(1.陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心,陜西 西安 710075;2.西安市第五醫(yī)院,陜西 西安 710082)
對胍基苯甲酸鹽酸鹽是一種常用的醫(yī)藥工業(yè)中間體,為頂體蛋白酶的抑制劑[1],用于合成抗胰腺炎藥物甲磺酸卡莫司他和萘莫司他,以及合成許多其他蛋白酶抑制劑。它們所含的胍基具有很強的生理活性,可在配基與受體及酶與底物間通過氫鍵作用形成特殊的相互作用,因此近些年對胍基化合物的研究日益深入。對胍基苯甲酸鹽酸鹽在抗生育領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景,有望發(fā)展成為避孕藥系列產(chǎn)品[2]。
對胍基苯甲酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,可溶性差,常以鹽酸鹽的形式用于藥物合成[3]。在對胍基苯甲酸鹽酸鹽合成中可能引入副產(chǎn)物及未反應(yīng)完全的反應(yīng)物,作為中間產(chǎn)品的控制需要提供準(zhǔn)確的檢測方法。
本文采用HPLC[4]法測定對胍基苯甲酸鹽酸鹽含量,具有操作方便、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、檢出限好等優(yōu)點。
對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品和樣品均為自制;純凈水;乙腈,色譜純;醋酸,分析純。
Ag135 電子天平;Waters 高效液相色譜儀;PHS-3C 型精密pH 計;KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。
1.2.1 對照品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品20.0 mg,置25 mL 量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
1.2.2 供試品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽供試品10.0 mg,置50 mL 量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
色譜柱為反相C18柱(250 mm ×4.6 mm);流動相為醋酸鹽緩沖液(pH =3.0)∶乙腈=70 ∶30(V/V);檢測波長251 nm;流速0.5 mL/min;進樣量20 μL,柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰計算不低于2 000。主峰與雜質(zhì)峰的分離度>1.5。
精密稱取干燥至恒重的對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品100 mg,置50 mL 量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,再精密量取0. 5,1. 0,2. 0,3. 0,4.0,5.0,6.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液,分別取供試品溶液各20 μL 進樣,以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。
圖1 對胍基苯甲酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride
以峰面積對濃度作線性回歸,得回歸方程y =7.346x + 2. 502 9,R2= 0. 999 3??梢娫? ~30 μg/mL 范圍內(nèi),峰面積與濃度線性關(guān)系良好。
精密量取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品溶液,按上述色譜條件,分別重復(fù)測定5 次,結(jié)果見表1。
表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiment
由表1 可知,對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.35%,表明儀器精密度良好。
精密稱取同一批樣品5 份,按供試品溶液制備方法平行處理并測定,結(jié)果見表2。
表2 重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility experiment
由表2 可知,對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.52 %,表明本方法重復(fù)性良好。
精密稱取同一批樣品制成供試液,分別于0,2,4,8,12 h 測定峰面積,結(jié)果見表3。
表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Results of stability experiment
由表3 可知,對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為2.44%,說明供試液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
精密稱取已知含量(96.97%)的同一批對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品9 份,每份約20 mg,分別精密加入一定量的對照品制備供試品溶液,按色譜條件測定,計算回收率,結(jié)果見表4。由表4 可知,回收率為99.45%,RSD=1.32%,表明加樣回收結(jié)果良好。
表4 回收率實驗結(jié)果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)
取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品及3 批次樣品進行測定,按外標(biāo)法以峰面積計算含量,見圖2、圖3。
圖2 對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograph of reference of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride
圖3 對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograph of sample of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride
由圖3 可知,3 批樣品的含量分別為95.1%,96.5%,95.7%。
采用HPLC 方法檢測對胍基苯甲酸鹽酸鹽的含量,保留時間為4.688 min,與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5,分離度良好,雜質(zhì)對對胍基苯甲酸鹽酸鹽的質(zhì)量檢測無干擾。在含量2 ~30 μg/mL 內(nèi),線性關(guān)系很好,精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好,具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。適用于對胍基苯甲酸鹽酸鹽工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制。
[1] 趙亞南,紀(jì)亞忠,呂加國,等. 頂體蛋白酶抑制劑4-胍基苯甲酸鹽對人精子功能的影響[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,21(12):1149-1151.
[2] 袁德祥,刁筱輝.4-羰基乙氧苯基-4-胍基苯甲酸酯鹽酸鹽對人精子頂體蛋白酶活性的影響[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志,1992,1(1):38-42.
[3] 趙煜松,曾海霞. 對胍基苯甲酸鹽酸鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].河北化工,2012,35(1):26-28.
[4] 國家藥典委員會.中國藥典:二部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.