嬰兒雙歧桿菌凍干保護(hù)劑配方的篩選與優(yōu)化

沈頤涵

摘 ? 要 ? 目的：構(gòu)建一種更好的嬰兒雙歧桿菌微生態(tài)制劑生產(chǎn)工藝，提高凍干菌粉的活菌存活率。方法：通過正交試驗(yàn)，對嬰兒雙歧桿菌凍干過程中加入的保護(hù)劑種類及其最佳配比進(jìn)行研究。結(jié)果：以脫脂奶粉10 %，甘露醇3 %，Vc-Na 1 %，味精0.5 %作為凍干保護(hù)劑，可使嬰兒雙歧桿菌凍干菌粉的活菌存活率由43%左右提高到85.42 %、活菌量保持在4.1×1010 cfu/g。結(jié)論：該配方用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)將有較好的效益。

關(guān)鍵詞 ? ?嬰兒雙歧桿菌 ? ?冷凍干燥 ? ?凍干保護(hù)劑 ? ?正交試驗(yàn)

中圖分類號：R944.9 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號：1006-1533（2014）23-0066-05

Screening and optimization of the formulation of cryoprotectants

for the lyophilized Bifidobacterium infantis

SHEN Yihan*

（Department of Quality Assurance， Shanghai SINE Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT ? Objective： To develop a better technique for the production of probiotic Bifidobacterium infantis and improve the survival rate of the lyophilized powder. Methods： In this improved technique， The types of cryoprotectants added in the lyophilization of Bifidobacterium infantis and their optimized formulations were studied by orthogonal test. Results： The survival rate of the lyophilized powder of Bifidobacterium infantis could be significantly improved from about 43% to 85.42% and the viable cell counts maintained at above 4.1×1010 cfu/g when a formulation of cryoprotectant consisting of 10% skim milk powder， 3% mannitol， 1% Vc-Na and 0.5% monosodium glutamate was used. Conclusion： This formulation will have a good benefit when applied to the probiotic production.

KEY WORDS ? ?Bifidobacterium infantis; lyophilization; cryoprotectant; orthogonal test

越來越多的科學(xué)研究表明，益生菌有益于人體的健康[1]。雙歧桿菌是人腸道中重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡的生理功能。雙歧桿菌屬專性厭氧菌，對培養(yǎng)環(huán)境敏感，對營養(yǎng)要求苛刻，活性保持較難。如何最大限度地保持雙歧桿菌制品的活性已成為研究熱點(diǎn)之一。以雙歧桿菌制成的微生態(tài)制劑主要依賴于發(fā)酵制備和凍干保藏技術(shù)。一些對雙歧桿菌凍干菌粉的研究結(jié)果表明，雙歧桿菌發(fā)酵制備的高密度菌體經(jīng)歷凍干后，菌體密度基本呈指數(shù)級下降[2]。因此需要改進(jìn)凍干保護(hù)劑配方以提高菌體的凍干存活率及嬰兒雙歧桿菌制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。在適當(dāng)保護(hù)劑的作用下，采用冷凍干燥技術(shù)能有效地保藏發(fā)酵制劑[3-7]。但是大量的研究顯示保護(hù)劑的效果存在菌株特異性[8-11]。Leslie等[3]發(fā)現(xiàn)海藻糖對大腸桿菌和蘇云金桿菌有良好的保護(hù)效果，而Linden等[12]的研究中海藻糖對植物乳桿菌卻沒有保護(hù)作用。因此，凍干保護(hù)劑的選擇在新開發(fā)益生菌制劑的應(yīng)用中尤為重要。在我廠目前工藝條件下，經(jīng)過凍干后嬰兒雙歧桿菌的凍干菌粉活菌數(shù)為2.0×1010 cfu/g左右，存活率僅為43%左右。本研究在其他條件固定的前提下，根據(jù)保護(hù)劑的種類通過正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選獲得嬰兒雙歧桿菌的最佳凍干保護(hù)劑配比，旨在構(gòu)建一種改進(jìn)的微生態(tài)活菌制劑生產(chǎn)工藝，用于嬰兒雙歧桿菌產(chǎn)品的生產(chǎn)。

材料與方法

主要材料

菌種：嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis），由我公司藥物研究所微生態(tài)制品研究室保藏。

種子培養(yǎng)基配方（g/L）：脫脂奶粉40、無水葡萄糖10、酵母膏10、硫酸銨2.5、磷酸二氫鉀0.75、磷酸氫二鉀1.5，異構(gòu)化乳糖液5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉10、牛肉膏5、葡萄糖5、乳糖10、磷酸二氫鉀2、硫酸鎂0.5、硫酸亞鐵0.05、L-半胱氨酸0.25，pH 6.5。

凍干保護(hù)劑配料：脫脂奶粉、甘露醇、Vc-Na、味精、異乳糖。

儀器設(shè)備

5 L、50 L發(fā)酵罐及配套系統(tǒng)（上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司）;GQ75B高速管式離心機(jī)（上海浦東天本離心機(jī)械有限公司）;Lyo-002Bb真空冷凍干燥機(jī)（Tofflon）;培養(yǎng)箱（Binder）;PHS-3E型精密pH計(jì)（上海雷磁）;Cary 50紫外分光光度計(jì)（Varian）;BP3100s電子分析天平（Sartorius）;滅菌鍋（Tony）;厭氧產(chǎn)氣袋（梅里埃）。

試驗(yàn)方法

菌種活化、傳代與接種：選用血瓊脂平板培養(yǎng)基活化保藏的菌種，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑單菌落制備皰肉管。

種子液制備：將培養(yǎng)好的皰肉管接種于400 ml種子培養(yǎng)液中，在37±1 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h，按10 %接種量接種至4 L種子培養(yǎng)液中，在37±1 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h。

菌粉的制備：將培養(yǎng)好的種子液按10 %接種量接種于50 L發(fā)酵罐中，在37±1 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)8～10 h;發(fā)酵菌液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，去掉上清液得菌體;然后根據(jù)離心獲得的菌體重量，按菌泥保護(hù)劑1∶1的比例，依次加入各類凍干保護(hù)劑，混勻后置于真空冷凍干燥機(jī)-38 ℃預(yù)凍5 h，再冷凍干燥約33 h，期間程序升溫至30 ℃，出箱后即得凍干菌粉，并檢測有效活菌數(shù)。

活菌數(shù)測定：采用血瓊脂平板計(jì)數(shù)法，梯度稀釋至約20～160個(gè)菌/ml后涂平板，置于37±1 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù);同時(shí)，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行雜菌檢測。

凍干存活率計(jì)算方法：凍干菌粉活菌數(shù)/加混合保護(hù)劑凍干前的活菌數(shù)×100%。

結(jié)果與討論

凍干保護(hù)劑的選擇

大分子保護(hù)劑的選擇與優(yōu)化

真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥兩個(gè)過程會造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡以及某些酶蛋白分子的鈍化，選擇有效的保護(hù)劑是解決這一問題的技術(shù)關(guān)鍵。不同的保護(hù)劑在冷凍干燥過程中發(fā)揮著不同的作用，大分子類保護(hù)劑主要在細(xì)胞表面起保護(hù)層作用，防止細(xì)胞受損。脫脂奶粉能穩(wěn)定細(xì)胞膜，提供細(xì)胞保護(hù)衣以免細(xì)胞受到損傷。它不管單獨(dú)使用還是與其他保護(hù)劑混合使用均具良好效果。一些大分子物質(zhì)如淀粉、麥芽糊精等，對菌體也具有較好的非滲透保護(hù)作用。為此，對10%含量的脫脂奶粉、淀粉和麥芽糊精進(jìn)行篩選（表1），結(jié)果表明，麥芽糊精的保護(hù)效果最差，而脫脂奶粉的保護(hù)效果優(yōu)于淀粉，因此選擇脫脂奶粉為大分子保護(hù)劑。進(jìn)一步對脫脂奶粉的添加量進(jìn)行優(yōu)化（圖1），發(fā)現(xiàn)隨著脫脂奶粉添加量的增加，嬰兒雙歧桿菌凍干存活率有所提高。綜合考慮凍干進(jìn)箱的液體體積以及脫脂奶粉的溶解性，選擇10 %的脫脂奶粉添加量為宜。

小分子保護(hù)劑的選擇與優(yōu)化

糖類的保護(hù)作用是因?yàn)樵诶鋬鲞^程中由于糖類形成氫鍵能力較強(qiáng)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能完整性。試驗(yàn)對含量6%的蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油和異乳糖進(jìn)行篩選（表2），結(jié)果表明，被譽(yù)為雙歧因子的異乳糖的凍干保護(hù)效果并不比甘露醇和甘油好;而用甘油作保護(hù)劑凍干獲得的菌粉，相對較為潮濕，凍干保護(hù)效果也沒有甘露醇好;因此選擇甘露醇作為小分子保護(hù)劑。對甘露醇進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，隨著甘露醇濃度的提高，菌體的凍干存活率有所上升。當(dāng)甘露醇濃度提高到一定程度后，嬰兒雙歧桿菌的凍干存活率呈一定的下降趨勢。這可能是由于甘露醇凍干后結(jié)晶水較多并會析出，如果條件控制不好，會使菌體死亡。因此添加過多的甘露醇會影響凍干菌粉的存活率，故選擇5 %的甘露醇含量為宜。

氧化還原保護(hù)劑的選擇與優(yōu)化

嬰兒雙歧桿菌是專性厭氧微生物，對氧極其敏感，所以降低嬰兒雙歧桿菌存在體系中的氧化還原電勢對其活力的保持尤為重要。Vc-Na能降低凍干保護(hù)劑的氧化還原電位，并消耗凍干過程中的部分氧氣。試驗(yàn)對含量0.5%的Vc-Na、味精和L-半胱氨酸進(jìn)行篩選（表3），結(jié)果表明，L-半胱氨酸的凍干保護(hù)效果最差，Vc-Na的凍干保護(hù)效果略為優(yōu)于味精。為增強(qiáng)保護(hù)劑的抗氧化效果，選擇Vc-Na和味精作為復(fù)合氧化還原保護(hù)劑，并對Vc-Na和味精的保護(hù)劑濃度分別進(jìn)行優(yōu)化（圖3），結(jié)果表明，隨著Vc-Na濃度的增加，嬰兒雙歧桿菌的凍干存活率有一定的提高，當(dāng)Vc-Na濃度達(dá)到一定程度后，菌株的凍干存活率呈緩慢上升趨勢，故選擇Vc-Na的含量為1 %。隨著味精含量的提高，菌株的存活率有一定的提升，但更高濃度的味精對提高菌粉的存活率效果不明顯，故選擇味精的含量為0.5 %。

凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化

單一的保護(hù)劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以凍干保護(hù)劑一般都是按一定配比混合使用的。復(fù)合保護(hù)劑中的各成分在冷凍干燥中均發(fā)揮著各自的作用，同時(shí)相互間又具有協(xié)同作用，只有在比例及濃度達(dá)到協(xié)調(diào)時(shí)，才能達(dá)到最佳的保護(hù)效果[10]。為了確定嬰兒雙歧桿菌真空冷凍干燥的最佳凍干保護(hù)劑配比，以菌體凍干存活率作為檢測指標(biāo)，用通過單因素篩選試驗(yàn)獲得的保護(hù)劑種類及優(yōu)選含量設(shè)計(jì)復(fù)合凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)（表4），以期最大限度的發(fā)揮凍干保護(hù)劑的功能，減少菌體在真空冷凍干燥過程中的損傷。綜合考察后最終選擇最佳凍干保護(hù)劑配比方案為A1B1C2D1（表5）。即由10%脫脂奶粉、3%甘露醇、1% Vc-Na和0.5%味精組成混合凍干保護(hù)劑。為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化配方進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際測得加入混合保護(hù)劑時(shí)嬰兒雙歧桿菌的活菌量為4.8×1010 cfu/ml，而凍干后的菌粉活菌量為4.1×1010 cfu/g，凍干存活率約為85.42 %，表明正交試驗(yàn)所得出的最佳凍干保護(hù)劑配比可行。

凍干菌粉穩(wěn)定性考察

目前我廠的凍干菌粉有效期為3個(gè)月（密封裝袋于2～8 ℃冷庫保存），在近效期時(shí)菌粉的活菌數(shù)基本接近5.0×108 cfu/g。取通過上述優(yōu)化方法生產(chǎn)的3批凍干菌粉，密封裝袋后置于2～8 ℃冷庫內(nèi)，進(jìn)行為期3個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)，用血瓊脂平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測，考察其活菌數(shù)的變化趨勢（表6）。結(jié)果表明，經(jīng)過3個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)，凍干菌粉的活菌數(shù)均大于企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)，符合要求。因此，可以認(rèn)為優(yōu)化的凍干保劑配方具有生產(chǎn)實(shí)用性。

討論

目前的許多研究發(fā)現(xiàn)，由于雙歧桿菌受自身的生長特性及周圍環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致冷凍干燥產(chǎn)品中的有效活菌數(shù)量會隨時(shí)間及儲存條件而急劇下降，最終影響產(chǎn)品的使用效果。本試驗(yàn)通過正交優(yōu)化獲得的最佳凍干保護(hù)劑配方，使菌粉的活菌存活率達(dá)到85.42 %，保存3個(gè)月的活菌數(shù)能夠基本保持在8.0×108 cfu/g，達(dá)到產(chǎn)品合格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究僅對凍干保護(hù)劑的配方進(jìn)行了優(yōu)化，未對凍干工藝參數(shù)進(jìn)行整體優(yōu)化，因此，后續(xù)可以通過對凍干工藝參數(shù)的優(yōu)化，以達(dá)到進(jìn)一步提升菌粉活菌數(shù)目的。綜上所述，采用該復(fù)合凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行真空冷凍干燥，可極大程度減少活菌量指數(shù)級下降情況的發(fā)生，提高菌粉中的活菌量，具有很好的應(yīng)用潛力。

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（收稿日期：2014-07-17）

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（收稿日期：2014-07-17）

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（收稿日期：2014-07-17）