綠木霉T43發(fā)酵液不同菌劑劑型的制備及野外應(yīng)用

鄧勛，宋小雙，尹大川，宋瑞清

(1．黑龍江省林業(yè)科學院森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040;2．東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

樟子松Pinus sylvestris var．mongolica是我國北方主要造林樹種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復方面發(fā)揮重要作用［1］。樟子松枯梢病是由松球殼菌Sphaeropsis sapinea(Fr．)Dyko et Sutton引起的一種傳染性病害，發(fā)生普遍、危害大，嚴重時可導致松林大面積死亡，目前主要以化學防治為主。該病屬于寄主主導性病害，應(yīng)以提高寄主抗性及降低病原菌種群數(shù)量為主要防治方向［2］。木霉菌Trichoderma spp．是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強和多機制性的特點。木霉的生物防治機理包括競爭作用、重寄生作用，以及產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類物質(zhì)對多種病原菌的抑制作用，此外，木霉菌株可定殖于植物根際，與植物根系形成共生體，改變植物的代謝功能，表現(xiàn)在促進植物生長［3］、增加養(yǎng)分吸收利用效率［4］、提高農(nóng)作物產(chǎn)量以及誘導植物產(chǎn)生抗逆性等方面［5-6］。因此篩選開發(fā)有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制劑產(chǎn)品，對保持樟子松林微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定、有效控制枯梢病的發(fā)生、減少化學農(nóng)藥的使用具有重要意義。應(yīng)用木霉菌劑在林業(yè)、藥用植物、農(nóng)業(yè)［7-8］以及花卉病害的生物防治中均取得了顯著效果，并且世界上有多種木霉商品化菌劑問世，在生物防治藥劑市場占據(jù)重要地位。

綠木霉T43課題組從以色列引進的1株廣譜高效木霉菌株，對多種林木病原菌包括樟子松枯梢病菌、楊樹爛皮病菌Cytospora chrysosperma、楊樹葉枯病菌Alternaria alternata、沙棘干縮病菌Fusarium sporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctonia solani，F(xiàn)usarium oxysporum，Pythium debaryanum、松爛皮病菌Cenangium ferruginosum均有較好的抑制效果，抑菌譜廣泛，其發(fā)酵液及乙酸乙酯提取物對松球殼孢菌室內(nèi)生長抑制率分別為92．94%和90．58%，病原菌菌絲生長稀疏或完全停止生長，說明綠木霉T43在液體發(fā)酵過程中，可以代謝出多種抑菌活性成分。在以綠色木霉菌分生孢子和抑菌活性成分制備菌劑的野外應(yīng)用中，對針葉苗木立枯病和樟子松枯梢病均取得了良好的防治效果，同時對針葉苗木還具有促生作用［9-13］。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，從商品化菌劑的研制開發(fā)角度出發(fā)，對綠木霉T43發(fā)酵液的水劑和粉劑劑型的制備工藝進行研究和優(yōu)化，同時測定其最佳的保存溫度和保存周期，并對樟子松枯梢病的防控進行了野外應(yīng)用試驗，以期開發(fā)出適合林木病害生物防治的可規(guī)模化制備的高效生防菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料木霉菌株為綠木霉Trichoderma virens T43，從以色列引進，抑菌譜測定表明對多種林木病原菌具有高效的抑制作用，保存于東北林業(yè)大學林學院森林微生物實驗室。

病原菌株為樟子松枯梢病病原菌—松球殼菌Sphaeropsis sapinea(Fr．)Dyko et Sutton，自遼寧省固沙研究所章古臺實驗林場樟子松人工林內(nèi)感病樟子松上分離，保存于東北林業(yè)大學林學院森林微生物實驗室。

培養(yǎng)基成分:(1)改良PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉17 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1．5 g/L。(2)PD培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，Mg-SO4·7H2O 1．5 g/L。(3)發(fā)酵罐用培養(yǎng)基。蛋白胨11 g/L，葡萄糖6 g/L，KH2PO410．5 g/L，CaCl20．8 g/L，MgSO4·7H2O 0．6 g/L，(NH4)2SO413 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5．0 mg/L，ZnSO4·7H2O 1．4 mg/L，CoCl2·6H2O 3．7 mg/L，MnSO4·H2O 1．6 mg/L。

儀器設(shè)備:HZQ-F100恒溫振蕩搖床，杭州海業(yè)HYSS-1050 50 L發(fā)酵罐，HPG-400H生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F超凈工作臺，F(xiàn)A2004N電子分析天平，QFN-D-1型全自動高壓滅菌鍋，奧林巴斯CX21生物顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同木霉發(fā)酵液菌劑劑型的制備 發(fā)酵種子液的制備:將活化的綠木霉菌塊接種到含有PDA培養(yǎng)基斜面的克氏瓶中，25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗下分生孢子，將孢子液濃度稀釋到104個孢子/mL，作為發(fā)酵接種的種子液。

不同發(fā)酵液的制備:分別采用實驗室搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵兩種方法制備發(fā)酵液。(1)搖瓶發(fā)酵液。取2．5 mL孢子懸浮液接種于250 mL(500 mL三角瓶)PD液體培養(yǎng)基中，150 r/min，25℃恒溫震蕩培養(yǎng)5 d，4℃保存?zhèn)溆谩?2)發(fā)酵罐發(fā)酵液。采用50 L發(fā)酵罐優(yōu)化條件，1 t發(fā)酵罐進行中試生產(chǎn)，使用發(fā)酵罐用培養(yǎng)基，裝料系數(shù)60%，轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min，發(fā)酵溫度28℃，通氣比1∶1，既通氣量為1．8 m3/h、初始pH7．0、培養(yǎng)周期120 h(5 d)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵液菌劑水劑的制備:在搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵的兩種發(fā)酵液去除大塊固形物后，加入3‰的苯甲酸鈉，并用濃鹽酸將pH值調(diào)至4．0后加入適量的聚三氧硅烷、OP-10、抗氧劑BHT以及抗紫外劑等，制備成發(fā)酵液水劑。其中搖瓶發(fā)酵液為A1，發(fā)酵罐發(fā)酵液為A2。

發(fā)酵液菌劑干粉劑的制備:發(fā)酵罐發(fā)酵液去除大塊固形物后，加入5%輕質(zhì)碳酸鈣、3%糊精，采用噴霧干燥的方法干燥。進風溫度140～170℃，出風溫度80℃。噴霧干燥后得到原粉，再加入茶皂素、白炭黑、抗氧劑BHT、抗紫外劑UV531、高嶺土等制備成發(fā)酵液干粉劑。進風溫度140～170℃設(shè)高、低兩檔，制備成兩種原粉，即菌劑A3(低溫干燥)和A4(高溫干燥)。

1.2.2 菌劑抑菌效果的室內(nèi)測定 采用菌絲生長抑制法測定抑菌率［14］。

水劑處理:將2種水劑(A1和A2)10 000 r/min離心10 min后取上清液，用0．22μm濾頭過濾除菌后加入PDA培養(yǎng)基中，搖晃均勻，使其濃度分別達到10，20，30，50倍，倒平板，待冷卻凝固后備用。

干粉劑處理:將兩種干粉劑(A3和A4)按照質(zhì)量比1∶10加入到無菌水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，將懸浮液10 000 r/min離心10 min后取上清液，用0．22μm濾頭過濾除菌后倒入PDA培養(yǎng)基中，搖晃均勻，配制成濃度梯度為200，500，1000，2000倍，倒平板，待冷卻凝固后備用。

在上述準備好的平板中接入樟子松枯梢病病原菌，以不添加菌劑的PDA平板作對照，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算對病原菌生長的抑制率，每處理3次重復。

生長抑制率(%)=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)÷對照菌落半徑×100

1.2.3 木霉菌劑保存溫度及保存期測定 菌劑經(jīng)過不同時間、不同溫度保存后，抑菌效果測定方法采用［14］。

保存溫度:分別將制備好的菌劑4種劑型放置于4，25，30℃條件下儲存6周后取樣測定。

保存時間:分別將制備好的4種劑型放置在25℃條件下，保存5，10，30，60，90，180 d分別取樣測定。

1.2.4 不同劑型對樟子松枯梢病的野外防治 野外防治基地為遼寧省固沙所章古臺實驗林場樟子松人工林，位于遼寧省阜新市彰武縣章古臺鎮(zhèn)。樟子松林齡25 a，胸徑15 cm，樹高15 m，枯梢病發(fā)病率70%以上，早期進行過化學藥劑防治，近5 a沒有人為干擾，適合進行生物防治。

防治試驗設(shè)計:采用以綠木霉T43發(fā)酵液為主要成分的4種劑型(A1，A2，A3，A4)，分別在2012年6月1日、6月20日和7月10日進行3次野外防治樟子松枯梢病試驗。

試驗設(shè)樟子松枯梢病的預防小區(qū)(未發(fā)病，病情指數(shù)0)、防治小區(qū)(發(fā)病)和對照區(qū)，每個小區(qū)60株樟子松。菌劑規(guī)格為水劑80 L/桶，干粉菌劑200 g/袋。將水劑A1和A2分別用水稀釋10倍，干粉菌劑A3和A4稀釋1000倍，采取活塞式壓力推進器進行樹冠噴霧的方式施藥，以噴施清水作對照。每個處理3次重復，小區(qū)隨機排列。

防治效果調(diào)查:噴藥前調(diào)查小區(qū)樟子松的病害等級，計算病情指數(shù)。噴藥30 d后，對預防和防治區(qū)分別調(diào)查，每個處理重復調(diào)查100株樹，計算病情指數(shù)和防治效果。將樟子松枯梢病發(fā)病等級劃分為4級(表1)，病害損失估計采取分級計數(shù)法，以病情指數(shù)表示發(fā)病程度。

病情指數(shù)=∑(病級株數(shù)×代表數(shù)值)÷(株數(shù)總和×最重一級代表數(shù)值)×100

防治效果(%)=(對照區(qū)病情指數(shù)-防治區(qū)病情指數(shù))÷對照區(qū)病情指數(shù)×100

表1 樟子松枯梢病發(fā)病等級劃分標準

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 測定和調(diào)查數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS 13．0采用Duncan方法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉發(fā)酵液菌劑不同劑型的制備

2.1.1 木霉發(fā)酵前后變化 分別采用搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵兩種方法制備綠木霉T43的發(fā)酵液，兩種發(fā)酵方法發(fā)酵前后參數(shù)變化見表2，3。比較兩種不同的發(fā)酵方式，發(fā)酵罐由于可以通氧保持罐體內(nèi)的空氣流通，120 h發(fā)酵后，菌絲產(chǎn)量(6．0%)高于搖瓶發(fā)酵(4．5%)，同時可產(chǎn)生分生孢子。

對于《紅樓夢》中的兒化詞，海洋女士曾做過粗略統(tǒng)計，僅《紅樓夢》前八十回，兒化詞就出現(xiàn)了一千次左右(包括重復使用)，平均每回達十多次，總條目達440條之多；僅第7回、24回、28回等，就各出現(xiàn)過80個以上，《紅樓夢》中兒化詞數(shù)量之多，由此可見一斑。

表2 搖瓶發(fā)酵前后發(fā)酵液參數(shù)變化

表3 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵前后參數(shù)變化

2.1.2 木霉菌不同劑型的制備工藝 制備工藝優(yōu)化后，得到木霉發(fā)酵液水劑和干粉粉劑的制備工藝。

綠木霉T43發(fā)酵液水劑制備工藝:綠色木霉發(fā)酵液過濾去掉大塊固形物后，使用HCl調(diào)整pH值到4．0，按下列配方制備成綠木霉T43抑菌活性成分水劑劑型:發(fā)酵液40%～60%，聚三氧硅烷0．5%～1．5%、OP-10 0．5%～1．5%、抗氧劑BHT 0．1%～0．3%、抗紫外劑UV531 0．2%～0．5%，3‰苯甲酸鈉，用無菌水補足100%。

綠木霉T43發(fā)酵液干粉劑:采用噴霧干燥的方法，在發(fā)酵液中加入4．0%～7．0%輕質(zhì)碳酸鈣、3．0%～5．0%糊精，進風溫度130～170℃，出風溫度80～90℃，噴霧干燥后得到原粉。按下列劑型配方制備成綠木霉T43抑菌活性成分干粉劑劑型:原粉50%～60%、茶皂素5．0%～7．0%、白炭黑5．0%～7．0%、抗氧劑BHT 0．15%～0．3%、抗紫外劑UV531 0．2%～0．4%、高嶺土補足至100%。

2.2 室內(nèi)測定的菌劑抑菌效果采用菌絲生長抑制法對不同劑型菌劑的抑菌能力進行的生物測定結(jié)果表明，4種劑型在不同稀釋倍數(shù)的處理中抑菌效果差異顯著，其中水劑A2的10倍液抑菌效果最好，達到64．58%，水劑在10倍和20倍，粉劑在500倍和1000倍對樟子松枯梢病菌均有明顯的抑制作用，隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑菌效果逐步減弱(圖1，2)。不同菌劑劑型之間比較，水劑效果好于粉劑。

相同劑型之間比較，相同條件下，水劑A2效果好于A1，分析原因，在發(fā)酵罐液體發(fā)酵條件下，由于有通氧條件存在，可以促進菌絲的生長，從而提高抑菌活性成分的代謝水平，提高相同體積發(fā)酵液中抑菌活性成分的含量，增加其抑菌率。

兩種粉劑A3和A4之間比較，A3抑菌效果好于A4，分析原因，菌劑A3的干燥溫度低于A4，較低的溫度可以降低發(fā)酵液中抑菌活性成分的失活率，制備成的菌劑可以更加有效抑制樟子松枯梢病菌的生長。

圖1 木霉菌水劑的抑菌作用

圖2 木霉菌干粉劑的抑菌作用

2.3 木霉菌劑保存溫度及保存期測定生物菌劑的保存溫度高低和保存期長短是決定該劑型是否具有商品化潛力的重要因素，本研究對綠木霉T43的4種劑型的保存溫度(圖3)測定中，隨著保存溫度的升高，4種劑型不同程度的出現(xiàn)抑菌效果下降，水劑A1和A2在4℃和25℃條件下，保存6周后，抑菌效果均保持在50%以上，抑菌效果差異不顯著;干粉劑對溫度變化比水劑敏感，3個保存溫度對干粉劑抑菌活性的影響存在顯著性差異;初步判斷4種劑型在室溫條件下(25℃)可以有效保存。

隨著保存時間的延長，菌劑的抑菌活性逐步降低，180 d后，4種劑型菌劑的抑菌效果下降到了20%左右。綜合保存溫度和保存時間的分析，綠色木霉T43的水劑劑型更適合長期保存(圖4)。

圖3 不同保存溫度對菌劑活力的影響

圖4 不同保存時間對菌劑活力的影響

2.4 不同木霉菌劑劑型對樟子松枯梢病的野外防治4種木霉菌劑型對樟子松枯梢病野外防治試驗結(jié)果顯示，各處理對樟子松枯梢病均有一定的預防和控制效果，不同菌劑類型處理間差異顯著，而兩種干粉菌劑對樟子松枯梢病的控制效果沒有顯著性差異，均高于72%，對于樟子松枯梢病的預防和控制，水劑效果均高于粉劑，水劑控制效果A1為78．88%，A2最好，為81．66%，4種劑型對樟子松枯梢病的預防效果均在50%左右(表4)。

表4 木霉菌劑不同劑型對樟子松枯梢病的防治效果

3 結(jié)論

綠木霉T43是引進的高效木霉菌株，本文對綠木霉T43的不同劑型制備工藝、保存條件以及對樟子松枯梢病防治的野外應(yīng)用進行了研究，室內(nèi)生物測定結(jié)果表明，采用發(fā)酵罐制備的發(fā)酵液其抑菌效果好于搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵罐液體發(fā)酵菌絲生長旺盛，抑菌活性成分代謝水平更高;不同菌劑劑型之間比較，發(fā)酵液水劑劑型抑菌效果好于干粉劑型，同時水劑劑型更有利于保存，在室溫條件下有效抑菌水平可以保存90 d以上。

在野外防治應(yīng)用中，各處理對樟子松枯梢病均有一定的預防和控制效果，不同菌劑類型處理間差異顯著，對于樟子松枯梢病的預防和控制，水劑效果均高于粉劑。

目前木霉菌劑主要以分生孢子可濕性粉劑為主，木霉菌代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分的菌劑研制和開發(fā)還有待深入研究。

［1］ 鄒良，孟慶超．東北內(nèi)蒙地區(qū)樟子松病害及防治［J］．防護林科技，1995，2:42-44．

［2］ 黃敬林，張力．樟子松枯梢病研究進展［J］．東北林業(yè)大學學報，2005，33(2):83-85．

［3］ Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al．Trichoderma speciesopportunistic，avirulent plant symbionts［J］．Nature Review Microbiology，2004，2:43-56．

［4］ Francesco V，Krishnapillai S，Emilio Ghisalberti L，et al．Trichoderma plant-pathogen interactions［J］．Soil Biology＆Biochemistry，2008，40(1):1-10．

［5］ Hanson L，Howell C．Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens［J］．Phytopathology，2004，94:171-176．

［6］ Vinale F，Sivasithamparamb K．A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants［J］．Physiological and Molecular Plant Pathology，2008(72):80-86．

［7］ 楊春林，席亞東，劉波微．哈茨木霉T-h-30對幾種蔬菜的促生作用及病害防治初探［J］．西南農(nóng)業(yè)學報，2008，21(6):1603-1607．

［8］ Vinale F，Ambrosio G，Abadi K，et al．Application of Trichoderma harzianum(T22)and Trichoderma atroviride(P1)as plant growth promoters，and their compatibility with copper oxychloride［J］．Journal of Zhejiang University Science，2004，30:2-8．

［9］ 李沖偉，楊立賓，宋瑞清．木霉菌株對金黃殼囊孢菌的抑菌效應(yīng)及機理［J］．林業(yè)科學，2012，48(9):88-94．

［10］ 尹大川，鄧勛，宋瑞清，等．引進木霉菌株T43對立枯病的抑制效益及對苗木的促生作用［J］．中國森林病蟲，2012，31(4):1-5．

［11］ 鄧龍，尹大川，宋瑞清．木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌的室內(nèi)外抑制效果［J］．黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學院學報，2012，25(4):33-34．

［12］ 鄧勛，宋瑞清，尹大川，等．高效木霉菌株對樟子松枯梢病的抑制機理［J］．中南林業(yè)科技大學學報，2012，32(11):21-27．

［13］ 楊立賓，宋瑞清，李沖偉．哈茨木霉菌株T28發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對致病疫霉的抑制及對體內(nèi)酶活性的影響［J］．林業(yè)科學，2013(3):110-115．

［14］ Sunil C，M Suresh，B Singh．Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f．sp．ciceris for integrated management of chickpea wilt［J］．Biological Control，2007，40(1):118-127．