落葉松—楊柵銹菌無(wú)性繁殖后代反應(yīng)型及接種研究

馬娥姣，余仲東，胥生榮，杜婷

(1．西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2．中國(guó)林業(yè)科學(xué)院資源昆蟲(chóng)研究所，云南 昆明 650000)

落葉松—楊柵銹菌Melampsora larici-populina Kleb．是冬孢菌綱銹菌目真菌，具有轉(zhuǎn)主寄生性，在落葉松上產(chǎn)生性孢子和銹孢子，在楊樹(shù)上產(chǎn)生夏孢子和冬孢子。該菌廣泛分布于楊樹(shù)栽培區(qū)，是引起青楊派和黑楊派等楊樹(shù)葉部病害的重要病原，嚴(yán)重危害幼苗和幼樹(shù)的生長(zhǎng)并造成材積損失和材質(zhì)下降［1］。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)學(xué)者對(duì)該菌的研究集中在生理小種劃分、遺傳分化、組織病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和病害流行學(xué)［2-5］。本研究探索了落葉松—楊柵銹菌無(wú)性系菌株夏孢子接種寄主的反應(yīng)型以及夏孢子不同接種濃度對(duì)寄主葉片夏孢子堆數(shù)量的影響，為進(jìn)一步研究落葉松—楊柵銹菌與楊樹(shù)互作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料鑒別寄主為美洲黑楊Populus deltiodes、健楊P．×euramericana cv．‘Robusta’、雜交楊P．deltiodes×P．trichocarpa、波蘭15號(hào)楊P．×euramericana cv．‘Polska 15A’、川楊P．×szechuanica的1年生扦插苗及卜氏楊P．purdomii 2年生實(shí)生苗，均來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)苗圃，在西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院溫室盆栽培養(yǎng)。

落葉松—楊柵銹菌混合菌系Hj于2011年8月采自吉林省長(zhǎng)春市凈月潭森林公園內(nèi)青楊，當(dāng)年接種于溫室栽培的卜氏楊上進(jìn)行擴(kuò)繁，培育5～7 d后，隨機(jī)選取4個(gè)成熟的、未被污染的夏孢子堆(命名為Hj1，Hj2，Hj3，Hj4)分別接種于卜氏楊做單孢子堆分離，并擴(kuò)大繁殖至足量，收取夏孢子干燥后，置于真空安瓿瓶在低溫4～7℃保存，于2013年5月分別擴(kuò)繁4個(gè)單孢化菌株備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株寄主反應(yīng)型測(cè)定 采取葉盤(pán)法測(cè)定寄主反應(yīng)型，操作方法參考［6］。采摘葉齡在5～20 d的各個(gè)鑒別寄主葉片，用直徑為16 mm的打孔器打取葉盤(pán)，葉盤(pán)背面向上放入培養(yǎng)皿中，將上述Hj1，Hj2，Hj3，Hj4菌株新鮮夏孢子分別接種在各寄主葉盤(pán)上，每個(gè)處理重復(fù)3次，以不接種夏孢子的葉盤(pán)作為對(duì)照。接種完成后用封口膜將培養(yǎng)皿封口，放入25℃溫室中培養(yǎng)，L∶D=16∶8。接種后定期觀察14 d并記載各處理的潛育期、反應(yīng)型(潛育期重復(fù)統(tǒng)計(jì)3次，取平均值)，寄主反應(yīng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照［7］。

1.2.2 夏孢子接種濃度對(duì)寄主產(chǎn)生夏孢子堆數(shù)量的影響 配制濃度為2%的瓊脂溶液，融化后倒在滅菌載玻片上形成薄膜，待其冷卻凝固后用直徑16 mm(201 mm2)的打孔器打取瓊脂盤(pán)，采用相同規(guī)格的打孔器打取各鑒別寄主葉盤(pán)［8］。稱取Hj1菌株夏孢子1，0．5，0．25，0．1 mg分別加入2 mL無(wú)菌水中制成夏孢子懸浮液，混勻后將其接種于瓊脂盤(pán)和寄主葉盤(pán)上，各處理重復(fù)3次。接種后的瓊脂盤(pán)和葉盤(pán)放入事先加入濾紙和少量無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，封口膜封口后置于25℃溫室培養(yǎng)，L∶D=16∶8。24 h后在光學(xué)顯微鏡(10×10倍)下觀察瓊脂盤(pán)上夏孢子的萌發(fā)個(gè)數(shù)，每個(gè)瓊脂盤(pán)觀察3個(gè)視野(2．54 mm2/視野)，取各視野夏孢子萌發(fā)數(shù)的平均值計(jì)算夏孢子接種濃度(個(gè)/瓊脂盤(pán))。寄主葉盤(pán)上夏孢子接種濃度即瓊脂盤(pán)上夏孢子接種濃度，觀察計(jì)算可知0．5，0．25，0．123，0．05 g/mL夏孢子懸浮液濃度對(duì)應(yīng)夏孢子實(shí)際接種濃度分別為12 388，4 827，1 899，950個(gè)/葉盤(pán)。接種15 d后統(tǒng)一統(tǒng)計(jì)各寄主葉盤(pán)上產(chǎn)生夏孢子堆的數(shù)量(個(gè))，同一寄主3次重復(fù)取平均值。

寄主葉盤(pán)夏孢子接種濃度=每個(gè)視野夏孢子萌發(fā)數(shù)÷2．54×201

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株寄主反應(yīng)型測(cè)定從各寄主對(duì)不同菌株的反應(yīng)型可以看出，寄主的反應(yīng)型可以分為免疫型和高度感病型2個(gè)類群(表1)。美洲黑楊對(duì)4個(gè)菌株均表現(xiàn)為免疫;健楊、雜交楊、波蘭15號(hào)楊、川楊、卜氏楊對(duì)各菌株都表現(xiàn)為高感，反應(yīng)型為3+～4，以上結(jié)果表明單孢化的4個(gè)菌株致病力一致，屬于同一個(gè)生理小種。

表1 單孢化的各菌株在鑒別寄主上的反應(yīng)型

與此同時(shí)，各菌株在不同鑒別寄主上的潛育期也表現(xiàn)出明顯差異(表2)。美洲黑楊在接種14 d內(nèi)未見(jiàn)其發(fā)病或者出現(xiàn)退綠、壞死等過(guò)敏性反應(yīng)，對(duì)4個(gè)菌株表現(xiàn)為免疫型。健楊、雜交楊、波蘭15號(hào)楊、川楊、卜氏楊的潛育期為4～6 d，符合高感品種發(fā)病規(guī)律，同上述反應(yīng)型測(cè)定結(jié)果一致。

表2 單孢化的各菌株在鑒別寄主上的潛育期 d

2.2 夏孢子接種濃度對(duì)產(chǎn)生夏孢子堆數(shù)量的影響

由圖1可知，夏孢子接種濃度對(duì)孢子堆數(shù)量的影響在不同寄主上表現(xiàn)有差異。在感病品種中，隨著夏孢子接種濃度的增加，健楊、雜交楊、波蘭15號(hào)楊、川楊和卜氏楊上產(chǎn)生夏孢子堆的數(shù)量也同時(shí)增加。當(dāng)夏孢子接種濃度達(dá)到最大值12 388個(gè)/葉盤(pán)時(shí)，各個(gè)寄主上夏孢子數(shù)量達(dá)到最大值，健楊夏孢子堆數(shù)目為73個(gè)，雜交楊為97個(gè)，波蘭15號(hào)楊為118個(gè)，川楊為161個(gè)，卜氏楊為123個(gè)。同一夏孢子接種濃度接種不同的楊樹(shù)品種時(shí)，產(chǎn)生的夏孢子堆數(shù)量也不同。

圖1 不同接種濃度對(duì)產(chǎn)生夏孢子堆數(shù)量的影響

美洲黑楊對(duì)該菌株免疫，當(dāng)夏孢子接種濃度達(dá)到12 388個(gè)/葉盤(pán)時(shí)一直不感病。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果證實(shí)，落葉松—楊柵銹菌混合菌系Hj無(wú)性繁殖后代Hj1，Hj2，Hj3，Hj4在各個(gè)常見(jiàn)鑒別寄主上具有相同的反應(yīng)型和潛育期，表明4個(gè)無(wú)性系后代遺傳多樣性單一，屬于同一個(gè)生理小種，同時(shí)也說(shuō)明了無(wú)性繁殖并不是落葉松—楊柵銹菌發(fā)生遺傳變異的主要原因，有性雜交才是導(dǎo)致該銹菌致病性和遺傳多樣性發(fā)生變異的主要因素。田呈明等［4］應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)落葉松—楊柵銹菌生理分化進(jìn)行了研究，并和致病性結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)該菌存在明顯的生理分化現(xiàn)象，各菌株之間的差異在0～33．1%之間。曹支敏認(rèn)為［9］，落葉松—楊柵銹菌致病性變異較為普遍，即使是在同一地域環(huán)境下，從不同年份、不同批次所采集的銹菌菌樣中所獲得的菌系之間致病性可出現(xiàn)變異。在轉(zhuǎn)主寄主(落葉松)大量存在的秦嶺林區(qū)天然林中，有性雜交是導(dǎo)致該銹菌致病性發(fā)生變異的主要原因。

接種研究結(jié)果表明落葉松—楊柵銹菌同一菌系夏孢子不同接種濃度對(duì)寄主上產(chǎn)生夏孢子堆數(shù)量有影響，同一接種濃度接種不同寄主后產(chǎn)生的孢子堆數(shù)量也有不同。對(duì)感病品種來(lái)說(shuō)，隨著夏孢子接種濃度的增加，感病寄主葉片單位面積產(chǎn)生的夏孢子堆數(shù)量增加，這一結(jié)論與Pei和Giorcelli［10-11］對(duì)落葉松—楊柵銹菌、柳樹(shù)銹菌Melampsora larici-epitea的相關(guān)研究結(jié)果相同。在研究接種濃度的基礎(chǔ)上，Pei通過(guò)相關(guān)性分析和建立模型認(rèn)為葉片上夏孢子堆數(shù)目和面積有關(guān);同時(shí)對(duì)整個(gè)葉盤(pán)上產(chǎn)生的夏孢子數(shù)目計(jì)數(shù)分析認(rèn)為夏孢子產(chǎn)量和夏孢子堆面積相關(guān)。Giorcelli也認(rèn)為，當(dāng)接種濃度超過(guò)50 units/cm2時(shí)，孢子堆面積由1．5～1．6 mm2減少到0．8～0．9 mm2;當(dāng)接種濃度超過(guò)100 units/cm2時(shí)，孢子堆面積減少至0．4～0．6 mm2。綜上，接種濃度、夏孢子數(shù)量、夏孢子堆面積之間互相影響，共同作用銹菌對(duì)寄主的侵染。因此在接種濃度一定的情況下，可以通過(guò)夏孢子數(shù)量、夏孢子堆面積和產(chǎn)量來(lái)綜合說(shuō)明銹菌和寄主互作。例如，研究中可引入侵染效率(侵染效率是指一個(gè)葉盤(pán)上夏孢子堆數(shù)除以葉盤(pán)上產(chǎn)生的夏孢子個(gè)數(shù))的概念來(lái)說(shuō)明不同接種組合的侵染情況，Pei研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)菌系的侵染效率為0．008～0．167，Giorelli研究證明E1小種的侵染效率為0．47，E3小種的侵染效率是0．64。Pei對(duì)柳樹(shù)銹病研究發(fā)現(xiàn)不同接種組合的侵染效率也不同［12］。以上侵染效率等的研究是通過(guò)葉盤(pán)法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，操作簡(jiǎn)單、方便，因此用葉盤(pán)法統(tǒng)計(jì)的侵染效率和植株反應(yīng)型測(cè)定結(jié)合起來(lái)鑒定銹菌生理小種不失為一種可靠的方法。

落葉松—楊柵銹菌廣泛分布于各種植區(qū)，對(duì)落葉松和楊樹(shù)產(chǎn)生一定危害。隨著該菌接種濃度增大，孢子堆數(shù)量增多，產(chǎn)生夏孢子數(shù)量變多，因此二次侵染基數(shù)變大，且感病品種潛育期短，很容易造成某一毒性小種在一地理區(qū)域快速擴(kuò)散、集中暴發(fā)，造成危害，因此造林時(shí)避免單一林分，并提高楊樹(shù)抗病性是目前預(yù)防落葉松—楊柵銹菌發(fā)生的重要措施。

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