非標記定量技術(shù)研究特應(yīng)性皮炎患者血清的差異蛋白

劉蘇俊 徐艦 趙斌 朱惠軍 孫焱 徐瑾 沈宏

非標記定量技術(shù)研究特應(yīng)性皮炎患者血清的差異蛋白

劉蘇俊 徐艦 趙斌 朱惠軍 孫焱 徐瑾 沈宏

目的應(yīng)用非標記定量技術(shù)研究特應(yīng)性皮炎患者血清中的差異表達蛋白,篩選特異性蛋白質(zhì)標記物。方法收集特應(yīng)性皮炎患者和健康對照者的血清各6份,處理和提取血清蛋白質(zhì),經(jīng)一維SDS-PAGE和蛋白膠內(nèi)酶解獲得肽段,應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,使用Mascot軟件查詢并用Scaffold軟件作相對定量分析。結(jié)果特應(yīng)性皮炎患者組和健康對照組的血清共檢測出76種差異表達超過1.5倍的蛋白質(zhì),患者組血清表達上調(diào)的有50種蛋白質(zhì),表達下調(diào)的有26種蛋白質(zhì),其中有26種蛋白質(zhì)僅在患者組表達,14種蛋白質(zhì)僅在對照組表達。結(jié)論特應(yīng)性皮炎患者與健康人血清間存在蛋白質(zhì)表達差異。

皮炎,特應(yīng)性;蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種近年來常用的一種發(fā)現(xiàn)疾病特異性分子的檢測方法,常用的有基于二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)分析(2D-DIGE)等,該方法存在一些局限性,分辨率不夠高,樣本需要量多且操作較復(fù)雜［1］。本文擬通過非標記(label-free)定量蛋白質(zhì)組技術(shù)這一較新的高通量檢測方法對特應(yīng)性皮炎患者血清進行檢測,以期發(fā)現(xiàn)一些新的特異性蛋白,為進一步深入研究特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機制等提供一定的依據(jù)。

一、對象

6例特應(yīng)性皮炎患者為我院門診或住院患者,男女各3例,年齡4～11歲,根據(jù)Hanifin-Rajka診斷標準確診為特應(yīng)性皮炎,SCORAD評分介于51～72分之間。對照血清來自年齡和性別匹配的6位健康自愿者,無特應(yīng)性疾病史,目前未患其他疾病。所有血清采集均經(jīng)過受采者監(jiān)護人知情同意?；颊呓M及對照組均于清晨空腹采集肘靜脈血3 ml,置于干燥、無抗凝劑的離心管內(nèi),4℃靜置2 h,4℃1 200×g離心10 min,分裝200 μl血清并于-80℃低溫保存。

二、主要試劑和儀器

Proteominer試劑盒(美國Bio-Rad公司),Bradford定量試劑盒(美國Bio-Rad公司),測序級胰蛋白酶(美國Promega公司),色譜純乙腈(德國MERCK公司),甲叉丙烯酰胺、碘乙酰胺和色譜純甲酸(美國FLUKA公司),IPGphor等電聚焦儀(美國Amersham公司),Etan Daltsix電泳儀(美國Amersham公司),Imagescanner凝膠成像儀(美國Amersham公司),Image-Master凝膠分析軟件(美國Amersham公司),激光顯微切割儀(美國Arcturus公司),反相液相色譜柱(美國Michrom公司),質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap(美國熱電公司),納升級高效液相色譜儀 LC-20AD及微量自動進樣器SIL-20AC(日本島津公司)。

三、方法

1.蛋白處理:血清樣品置冰上室溫溶解。從患者組和對照組每組的6個血清標本中各取100 μl混合,形成兩個組各600 μl混合血清。嚴格按照Proteominer試劑盒使用說明書進行實驗操作,以去除高豐度蛋白質(zhì)。用改良的Bradford法測定收集蛋白樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

2.一維SDS-PAGE:用7 cm的12%小膠電泳2 h,考馬斯亮藍染色并脫色過夜后,出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。

3.蛋白膠內(nèi)酶解:將蛋白條帶從凝膠切下,切碎后(約1 mm×1 mm)置于96孔板中。加入200 μl 100 mmol/L碳酸氫銨溶液/50%乙腈脫去考馬斯亮藍染料。用200 μl乙腈將凝膠脫水至白色顆粒狀。加入12.5 mg/L胰蛋白酶溶液覆蓋凝膠顆粒,4℃放置30 min,使凝膠完全泡脹。加25 μl 25 mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒,置于37℃控溫搖床內(nèi)16 h。取出冷卻至室溫后加入3 μl甲酸終止反應(yīng)。用50 μl 0.1%三氟乙酸(TFA)/50%乙腈提取2次,每次超聲5 min,合并2次提取液。用Speed-vac真空濃縮后,每樣品用20 μl水/0.1%甲酸溶解。

4.液相色譜分離:反相液相色譜柱的反相柱為75 μm×15 cm(Magic AQ C18 填料,3.5 μm 粒徑,2 000 ? 孔徑),流動相A水/0.1%甲酸,B乙腈/0.1%甲酸,流速300 nl/min。梯度程序:0～5 min,B相為2%;5～95 min,B相由5%升至35%;95～96 min,B相升至90%;96-101 min,保持90%;101～103 min,B相由90%降為2%,103～120 min,保持2%。樣品以9 600×g離心10 min后放入進樣瓶中,由儀器自動進樣15 μl。設(shè)定批處理程序,經(jīng)高效液相色譜分離直接通過納電噴霧接口進入自動串級質(zhì)譜分析(Auto-MS/MS)。

5.LTQ-Orbitrap的參數(shù)設(shè)置:電噴霧電壓1 800 V;MS掃描范圍350～1 800 Da;每次掃描選擇10個強度最高的母離子進行MS/MS掃描。實驗部分于復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院指導(dǎo)完成。

6.數(shù)據(jù)庫搜索:通過Mascot軟件2.3版本進行查詢,ESI所得結(jié)果用MSConverter(Proteowizard平臺,華盛頓州大學(xué),美國)進行格式轉(zhuǎn)換為mgf文件。搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫為瑞士 SWISSPROT;檢索種屬為人,Homo Sapiens［human］;母離子質(zhì)量偏差容忍度25 ppm,碎片質(zhì)量偏差容忍度0.6 Da;最大允許漏切位點為2;酶為胰蛋白酶;甲硫氨酸氧化和蛋白質(zhì)N端乙酰化為可變修飾。用Scaffold(3.4.3版本,Proteome Software公司,美國)軟件計算搜庫結(jié)果的置信度,肽段和蛋白的置信度是通過PeptideProphet和ProteinProphet(系統(tǒng)生物學(xué)研究所,美國)算法分別計算。通過選擇置信度高于90%為接受標準,最終結(jié)果的假陽性率小于5%。

7.相對定量分析:Scaffold軟件同時也用于相對定量分析,對于每一張得到鑒定的譜圖都把置信度納入考慮后,計算得到每一個蛋白的定量值。定量方法是經(jīng)過修改的譜圖計數(shù)法。

表1 特應(yīng)性皮炎患者和對照血清中差異大于2倍的蛋白質(zhì)

四、結(jié)果

患者組及對照組樣品分別進行3次重復(fù)實驗,實驗結(jié)果具有高度的相似性。選擇3次重復(fù)實驗中均鑒定到的蛋白質(zhì)做進一步的差異倍數(shù)統(tǒng)計分析。以差異倍數(shù)大于1.5倍作為參考標準篩選差異表達蛋白質(zhì)。本研究中,特應(yīng)性皮炎患者組和健康對照組的血清共檢測出181種蛋白質(zhì),其中患者組167種,對照組155種,兩者共有蛋白質(zhì)為141種?；颊呓M高表達的有50種蛋白質(zhì),低表達的有26種蛋白質(zhì),其中有26種蛋白質(zhì)僅在患者組表達,14種蛋白質(zhì)僅在對照組表達。表1列出差異大于2倍及僅在對照組或者患者組出現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)。差異大于1.5倍而小于2倍的比較重要的蛋白還有細胞外超氧化物歧化酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、補體因子B、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清淀粉樣蛋白A1、α1抗糜蛋白酶和基膜聚糖等。

五、討論

定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以精確測量多個不同生理或病理條件下生物樣本中蛋白質(zhì)表達量的變化［2］。非標記定量是其中一種較為常用的研究方法,一般多為相對定量,實驗操作簡單,對樣本的操作少,在檢測肽段的數(shù)量、蛋白質(zhì)的覆蓋率和分析通量方面具有較大優(yōu)勢,但在進行相對定量時,低豐度蛋白不易檢測。

蛋白質(zhì)組學(xué)常用于腫瘤類疾病中某些標志物的檢測。國內(nèi)已有學(xué)者在瘢痕疙瘩［3］和銀屑?。?］等皮膚病的研究中,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了疾病的某些特異性蛋白。

本文應(yīng)用非標記定量技術(shù)對特應(yīng)性皮炎患者和健康對照血清進行比較蛋白組學(xué)研究,檢測到了76種明顯差異表達的蛋白。患者組高表達的有50種蛋白質(zhì),其中26種僅在患者組表達。對照組高表達的有26種蛋白質(zhì),有14種僅在對照組表達。本研究中發(fā)現(xiàn)的樣本總蛋白數(shù)量比較少,可能與樣本處理和蛋白提取等過程中部分蛋白丟失有關(guān),這需要在以后研究中改進實驗方法。

研究中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白主要與免疫、炎癥、感染及增殖和分化等有關(guān),現(xiàn)對其中一些蛋白進行初步討論,這些蛋白將作為我們后續(xù)研究的重點。

細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase,EC-SOD)不僅能清除超氧化物,保護組織免受炎癥損傷,而且還可以在免疫反應(yīng)過程和信號啟動中有重要的調(diào)節(jié)作用［5］。本研究結(jié)果中患者血清中EC-SOD較健康對照組明顯下降,提示EC-SOD下降可能與特應(yīng)性皮炎患者明顯的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

彈性蛋白結(jié)合蛋白(Ficolin-2)是由肝臟合成并分泌至血液中,能夠激活補體的凝集素途徑［6］,在針對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、沙門菌等細菌的天然免疫中有重要作用。Cedzynski等［7］在兒童患者中發(fā)現(xiàn)血清Ficolin-2的下降與合并過敏性疾病的呼吸道感染有關(guān),且與過敏的關(guān)系比感染的關(guān)系更密切。本研究發(fā)現(xiàn),特應(yīng)性皮炎患者血清中的Ficolin-2水平較健康對照明顯下降。特應(yīng)性皮炎患者皮損表面常出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌定植或感染,可顯著加重特應(yīng)性皮炎的病情,這是否與其血清中的Ficolin-2水平下降有關(guān)值得進一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn),腱糖蛋白(Tenascin)基因［8］和蛋白［9］在特應(yīng)性皮炎皮損的表達明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn),其在血清中亦明顯升高,提示腱糖蛋白在特應(yīng)性皮炎的發(fā)病中有一定作用。

單核細胞分化抗原(CD14)的159C/T基因多態(tài)性與特應(yīng)性哮喘的易感性有關(guān)［10］,CD14-159 C/T基因型的血清可溶性CD14水平升高［11］。本研究中特應(yīng)性皮炎患者血清的可溶性CD14水平顯著升高,可能與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病有相關(guān)性。

在本研究檢測到的特應(yīng)性皮炎患者血清比健康對照高表達的52種蛋白中,有很多蛋白是與細菌感染和炎癥等有關(guān),如N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、補體因子B、視黃醇結(jié)合蛋白4等。還有些蛋白如角蛋白1、角蛋白2、角蛋白9、角蛋白10以及角質(zhì)形成細胞分化相關(guān)蛋白與維持皮膚角質(zhì)層的完整性有關(guān)。

2008年有學(xué)者對特應(yīng)性皮炎患者血漿中糖蛋白用2DDIGE方法進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究［12］,發(fā)現(xiàn)16種蛋白在特應(yīng)性皮炎中表達上調(diào)或下調(diào)。其中,有2個蛋白在本研究中也被發(fā)現(xiàn)。血紅素結(jié)合蛋白在特應(yīng)性皮炎血漿表達下調(diào),與本研究一致。纖維蛋白原γ鏈在上述研究中為血漿低表達,而本研究中為血清高表達,可能與血漿和血清標本不同及檢測方法不同等因素有關(guān)。

我們應(yīng)用非標記定量技術(shù)研究了特應(yīng)性皮炎患者血清的蛋白質(zhì)組,得到一些差異表達蛋白。這些差異蛋白還需要在大樣本量的研究證實。

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Application of label-free quantitative proteomics in the screening for differentially expressed serum proteins in patients with atopic dermatitis

Liu Sujun，Xu Jian，Zhao Bin，Zhu Huijun，Sun Yan，Xu Jin，Shen Hong.Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Shen Hong，Email:shenhangzhou@sina.com

Objective To screen differentially expressed serum proteins by label-free quantitative proteomics in patients with atopic dermatitis，in order to discover serum protein markers for atopic dermatitis.Methods Serum samples were collected from 6 patients with atopic dermatitis and 6 healthy human controls.Then，the samples from the patients were pooled together，so with those from the controls.Proteins were extracted from the two joint serum samples followed by separation with one-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis(SDS-PAGE).Peptides were obtained by enzymolysis in protein gels，which were subsequently identified by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The Mascot software was used for database searching，and the Scaffold software for relatively quantitative analysis of proteins.Results Totally，76 proteins with a difference of greater than 1.5 folds were identified between the serum samples of patients with atopic dermatitis and controls.There were 50 up-regulated and 26 down-regulated serum proteins in the patients compared with the healthy controls.Among these differentially expressed proteins，26 were only detected in the sera of the patients，and 14 proteins in those of the controls.Conlusion Differences exist in the expression of serum proteins between atopic dermatitis patients and healthy people.

Dermatitis，atopic；Proteomics

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.016

浙江省自然科學(xué)基金(Y2091229)

310009杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

沈宏,Email:shenhangzhou@sina.com

2013-12-23)

(本文編輯:顏艷)