miR-145在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

楊學(xué)文，高 峰，滕鳳猛（江蘇省中醫(yī)院／南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210029）

胃癌患者就診時(shí)多數(shù)已處于進(jìn)展期，其早期病變確診率不足10%［1］。胃癌的發(fā)生通常是一個(gè)多步驟、涉及多因素的過(guò)程，其機(jī)制可能與某些胃癌相關(guān)基因的改變有關(guān)。microRNAs（miRNA）為內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為19～24 nt，其異常表達(dá)可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為腫瘤早期診斷及判斷預(yù)后的指標(biāo)［2］。目前已有研究證實(shí)miR-145在膀胱癌、宮頸癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中均有不同程度的表達(dá)下調(diào)。本研究通過(guò)比較miR-145在正常組織及胃癌組織中的表達(dá)差異及與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討miR-145作為胃癌早期診斷的預(yù)測(cè)價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源選擇2011年2月至2012年6月本院就診的67例胃癌患者，均經(jīng)胃鏡檢查和活檢病理證實(shí)。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療以及其他針對(duì)腫瘤的特殊治療，其中男41例，女26例，年齡33～81歲，平均61.2歲。TNM分期以UICC 2010年第7版為標(biāo)準(zhǔn)。取腫瘤邊緣外5cm處的非癌胃黏膜作為對(duì)照，所有組織標(biāo)本均置于液氮保存。

1.2 試劑用于RNA提取的Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR購(gòu)自Takara公司，miR-145和U6引物由生物工程（上海）股份有限公司加工合成。

1.3 方法取胃癌和胃癌腫瘤邊緣外5cm正常組織各100 mg用l mL Trizol浸泡，勻漿器搗碎，經(jīng)氯仿分離，異丙醇沉淀，75%乙醇清洗，離心后用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，記錄A260／280后-80℃保存。采用Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（miR-145和U6），總體系為10μL，RNA總量小于500ng，37℃孵育15min（85℃孵育5s）。熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）總體系為20μL，cDNA總量小于100ng，SYBR 10μL，上游引物10μmol，下游引物10μmol，起始模板變性95℃1min，PCR循環(huán)中95℃10s，60℃40s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-145和U6的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=（CtmiR-145-CtU6）胃癌-（CtmiR-145-CtU6）正常。miR-145和U6的反轉(zhuǎn)錄引物及上下游引物見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-145在胃癌及正常組織的表達(dá)67例胃癌組織標(biāo)本中僅有13例miR-145表達(dá)量高于正常組織，僅占19.40%，其他54例（80.60%）標(biāo)本中的表達(dá)明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-145在胃癌和正常組織中的表達(dá)

2.2 miR-145與胃癌臨床病理的相關(guān)性miR-145在胃癌患者的性別、年齡及不同TNM分期中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是與胃癌患者的組織學(xué)分級(jí)（χ2=18.135，P＜0.01）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（χ2=31.146，P＜0.01）密切相關(guān)，見(jiàn)表2。

表1 miR-145和U6相關(guān)引物

表2 miR-145與胃癌臨床病理的相關(guān)性（n）

3 討 論

目前有研究證實(shí)miR-145可以通過(guò)抑制癌基因表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。miR-145可以靶向c-MYC、腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）等多種癌基因，抑制癌基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［3-4］。

目前對(duì)于miRNA在腫瘤中表達(dá)的檢測(cè)方法存在多樣性，張晴等［5］采用原位分子雜交法，檢測(cè)91例人乳腺癌與38例乳腺良性病變中miR-145表達(dá)情況。Schepeler等［6］采用基因芯片技術(shù)對(duì)49例結(jié)腸癌的miRNA譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中miR-145表達(dá)水平明顯低于周圍正常組織。本研究采用miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)miR-145反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，觀察其在組織中的表達(dá)情況。該方法具有簡(jiǎn)便、靈敏及快速的優(yōu)點(diǎn)，miR-145在54例標(biāo)本中表達(dá)顯著低于其在正常組織中的表達(dá)，與龔文容等［7］在結(jié)直腸癌中觀察到的miR-145表達(dá)情況一致。

miR-145在多種腫瘤中呈低表達(dá)，但是不同腫瘤或相同腫瘤不同學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-145與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性存在差異。師婕和張林燕［8］采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)宮頸鱗癌miR-145的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ期與Ⅰ～Ⅱ期以及在宮頸鱗癌高、中分化與低分化組中miR-145的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。褚以忞等［9］的研究發(fā)現(xiàn)miR-145與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)顯著性相關(guān)。然而，在本研究中miR-145與胃癌患者組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），這可能與胃癌患者的選擇、數(shù)量有關(guān)，也與實(shí)時(shí)定量PCR中引物的設(shè)計(jì)、內(nèi)參的選擇、擴(kuò)增的條件等因素密切關(guān)系。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了miR-145在胃癌患者中表達(dá)呈下調(diào)，可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系，為胃癌細(xì)胞進(jìn)行miR-145的相關(guān)功能學(xué)研究及可能的信號(hào)調(diào)控通路研究提供了一定的基礎(chǔ)，為胃癌靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。

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