一種高效的靈芝菌絲體總蛋白的提取方法

唐奕詩 馬楚瑩 周玉萍 陳瓊華 田長恩

(廣州大學生命科學學院植物抗逆基因功能研究廣州市重點實驗室 廣東廣州 510006)

2012年中國科學家利用最新的高通量測序技術和光學圖譜技術,自主完成了染色體水平靈芝基因組精細圖譜,首次實現(xiàn)了中藥研究在基因組尺度尋找新的代謝功能基因及調控元件,為代謝網絡重構及靈芝種質保護與創(chuàng)新奠定了基礎,推動靈芝成為第一個“模式藥用真菌”[1-2]。近年靈芝遺傳轉化體系已逐步建立[3-4],今后可以通過代謝工程來改造或研究細胞代謝途徑的關鍵酶,從而提高靈芝免疫調節(jié)蛋白的產量[5],或以靈芝菌絲作為外源基因的表達系統(tǒng),使用轉基因靈芝發(fā)酵生產珍貴稀有的藥物蛋白等等,這些研究必將需要確定靈芝菌絲細胞中蛋白質表達的定量變化。

圖1 靈芝菌絲體的制備

圖2 不同方法制備的蛋白質樣品SDS-PAGE電泳圖譜

蛋白質組學研究通過對生物體內表達的各種蛋白質進行識別和定量分析,確定它們在細胞內外的定位、修飾、相互作用和功能,以期獲得對生命本質和活動規(guī)律的全景式認識[6]。蛋白質的提取是蛋白質組學研究的首要步驟,其質量的好壞直接影響蛋白質表達分析研究的開展及其結果的準確性。因此,在靈芝蛋白質組學研究中,獲取相關胞內蛋白質,并保持其完整性是研究的首要問題。目前僅有靈芝子實體原基和破壁孢子粉中提取蛋白質方法的報道[7-8]。本文以韋伯靈芝發(fā)酵菌絲為研究對象,在前人工作的基礎上選用了超聲波法、液氮冷凍研磨法和超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法來破碎細胞壁,采用高濃度尿素-硫脲溶解胞內蛋白質的方法提取菌絲總蛋白,并分析不同蛋白酶抑制劑對胞內蛋白酶的抑制作用。本研究旨在建立一種高效靈芝菌絲體總蛋白的提取方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)采自廣州花都芙蓉彰,由本研究組分離純化得韋伯靈芝菌株TZC-1[9-10]。

綜合PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、VB12mg/L、瓊脂15g/L,pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基:綜合PDA培養(yǎng)基中去掉瓊脂,加入酵母膏5g/L,pH=4.8。

1.1.2 主要生化試劑

尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑混合物、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris堿等均購自生工生物工程（上海)股份有限公司;蛋白分子量標準品購自Fermentas。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體制備

韋伯靈芝菌絲經斜面活化后,轉接到綜合PDA平板上,26℃培養(yǎng)5d,用無菌打孔器將平板菌種制成直徑10mm,厚2mm的菌種塞,將菌種塞接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL錐形瓶中,每瓶接入3個菌塞,在26℃、160r/min條件下恒溫震蕩5d,用蒸餾水反復清洗菌絲球5次,最后用濾紙反復吸干菌絲體水份,獲得新鮮菌絲球。

表1 含不同蛋白酶抑制劑提取的樣品中蛋白質濃度

圖3 蛋白酶抑制劑對蛋白樣品的影響

1.2.2 蛋白質提取方法

參考胡斌斌發(fā)表的真菌總蛋白質提取方法[11],但有所改進,詳細步驟為:

方法1:向預冷的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,將菌絲體研磨成粉末;稱取100mg菌絲粉末,加入750μL裂解液(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF)懸浮起菌絲粉末;4℃冰浴30min,期間每隔5min混勻一次;用超聲波細胞破碎儀在冰浴中破碎菌體(750W,超聲6s,間隔1s,超聲20次);4℃12000r/min離心10min,棄沉淀保留上清液。

方法2:向裝有液氮的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,在液氮中將菌絲體研磨成粉末,接著按方法Ⅰ完成。

方法3:向裝有液氮的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,在液氮中將菌絲體研磨成粉末;加入750μL提取液Ⅰ(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF或不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物)。4℃冰浴60min;加250 μL提取液Ⅱ(4%CHAPS,4%DTT,0.5%SDS),渦旋30s×6次,間隔1min置于冰上;4℃10000r/min離心10min,棄沉淀保留上清液。

1.2.3 蛋白質濃度測定

蛋白質濃度按Bradford法[12]測定:根據(jù)測定不同濃度的標準牛血清白蛋白(BSA)在595nm處的吸光值(A),繪出標準曲線,BSA濃度為橫座標,A595值為縱座標,其方程為:Y=0.894X+0.0164,R2=0.9968。樣品中的蛋白質濃度根據(jù)樣品的吸光值、稀釋倍數(shù)和菌絲體重量算出,其單位為mg/g菌絲。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳

采用等體積上樣的方法,取提取的蛋白質溶液15μL加3.7μL上樣緩沖液,混勻后取12μl進行上樣,電泳結束后凝膠用考馬斯亮藍進行染色處理。

2 結果與分析

2.1 菌絲體的制備

靈芝菌絲經發(fā)酵后,收集的菌絲球用蒸餾水反復洗滌可防止培養(yǎng)基中蛋白組分的污染;洗滌過的菌絲體含大量水分,需要用濾紙吸干,有利于在液氮中研磨成粉末。制備菌絲體時,需要控制好時間,菌絲樣品正常呈淡黃色(圖1A),如果菌絲干燥后暴露在空氣中時間過長,菌絲將會變成褐色(圖1B)。實驗結果顯示:在相同提取條件下,以褐色菌絲體為材料提取的蛋白質濃度明顯低于淡黃色菌絲體。

2.2 不同方法提取蛋白質的比較

實驗通過超聲波、超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨和液氮冷凍研磨等三種方法破碎靈芝菌絲細胞壁,采用高濃度尿素-硫脲法來溶解細胞蛋白質組,所制備蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳和按Bradford法測定蛋白質濃度,根據(jù)電泳圖譜及蛋白質濃度來評估不同方法的效果。

從電泳圖譜(圖2)分析,超聲波法所得到的樣品中蛋白質數(shù)量較其他兩種方法少,蛋白條帶不清晰,分布不均勻,主要集中在低分子量14.4～45.0kDa范圍;超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的樣品中蛋白質條帶豐富,分布均勻,但條帶不很清晰,泳道兩側拖帶嚴重,推測可能是部分降解所致;液氮冷凍研磨法提取的樣品中蛋白質數(shù)量與超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的蛋白質數(shù)量基本一致,蛋白條帶豐富,分布均勻,條帶清晰。三種方法提取樣品的蛋白質濃度分別為:9.95±0.41、17.47±0.39和15.85±0.54mg/g菌絲。根據(jù)電泳圖譜和蛋白質濃度來比較,認為方法Ⅲ的提取方法適合靈芝菌絲體蛋白質組的制備。

為了優(yōu)化方法Ⅲ,提取液I中使用不同種類和不同濃度的蛋白酶抑制劑,分析所提蛋白質的質量,其結果表明(圖3):5種濃度的蛋白酶抑制劑混合物和20mmol/L PMSF所提取的蛋白質樣品的電泳圖譜沒有明顯差異,蛋白質條帶都比較清晰且條帶的豐富性較好,條帶分布均勻;所有樣品的蛋白質濃度均不存在顯著性差異(表1)。從結果可以判斷,PMSF和蛋白酶抑制劑混合物均能很好地抑制靈芝菌絲內源的蛋白酶,防止所提取蛋白質降解,且與蛋白酶抑制劑混合物的濃度無關。

3 討論

在靈芝蛋白質組學及靈芝轉基因菌株生產重組蛋白的研究中,獲取菌絲胞內蛋白質,并保持其完整性是研究的首要問題,其質量的好壞直接影響蛋白質表達分析研究的開展及其結果的準確性。因此,建立一種高效的菌絲體總蛋白的提取方法對作為“模式藥用真菌”靈芝生物學研究具有十分重要的作用。

真菌的細胞壁破碎是提取蛋白質效果好壞的關鍵。已知靈芝細胞壁具有堅固的雙層結構,由肽聚糖骨架組成,聚糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量多、交聯(lián)程度緊密,結構十分致密堅韌,不易破碎[13]。據(jù)文獻介紹,破碎靈芝孢子及子實體的方法有液氮研磨法[7]、超聲波法[14]及機械粉碎法[8,15]等三種。超聲波破壁法操作簡單,但耗時較長且操作過程中產生的熱量可能造成蛋白質降解;液氮冷凍研磨法,成本低且低溫條件可避免蛋白質降解[16];機械粉碎法即采用萬能粉碎機將烘干的子實體及孢子粉碎成細小粉末,適合制藥業(yè)生產[15]。本研究采用超聲波法、超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法及液氮研磨法等三種不同細胞壁破碎的方法,其結果表明,三種方法均能破碎靈芝菌絲細胞,得到胞內蛋白質(圖2),但是超聲波法提取的樣品中蛋白質數(shù)量較少,有部分蛋白質降解現(xiàn)象;超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的樣品雖然蛋白質數(shù)量較多,同樣有部分蛋白質降解。在實驗設計時,已考慮到超聲波發(fā)熱引起蛋白質降解的問題,實驗樣品處于冰浴,但結果還是出現(xiàn)一定程度蛋白損傷。因此,今后使用超聲波法破碎靈芝菌絲細胞時需要優(yōu)化超聲波功率、超聲波工作時間及間隔時間,以保證所提蛋白質的數(shù)量及完整性[17]。與劉曉云[7]用液氮冷凍研磨法提取靈芝子實體原基的報道相似,本文發(fā)現(xiàn)液氮冷凍研磨法提取的蛋白質樣品條帶豐富,分布均勻,在分子量14.4～116.0kDa區(qū)間內分布大量的清晰蛋白帶,且蛋白濃度達到15.85±0.54mg/g。因此,認為液氮冷凍研磨法比其它兩種方法更適合于靈芝菌絲蛋白質組的制備。

蛋白質提取常使用含變性劑、表面活性劑和還原劑等成分的提取液,其中常用于真菌總蛋白質提取的方法有尿素-硫脲法[11,18]。變性劑如尿素可以使蛋白質變性,形成完全隨機的構象并暴露所有離子基團于溶液中,因此可增加蛋白質的溶解度;硫脲則可輔助尿素對蛋白質進行變性,同時增加膜蛋白的溶解度,以制備包含更完整蛋白質組的樣品,提高蛋白質組的完整性[18]。因此,本文參考胡斌斌[11]報道的方法,在提取液Ⅰ中使用高濃度的尿素結合硫脲對靈芝菌絲蛋白質進行4℃低溫60min的溶解,最大限度提高總蛋白的數(shù)量;隨后在提取液Ⅱ中進一步使用表面活性劑CHAPS和SDS來促進蛋白質溶解、還原劑DTT則可保持二硫鍵處于還原狀態(tài),增加蛋白質溶解度。另外,為了防止蛋白質降解、保持蛋白質完整性,實驗中比較了PMSF和不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物對增加蛋白質穩(wěn)定性的作用,實驗結果表明(圖3和表1),兩種蛋白酶抑制劑均能很好地抑制靈芝菌絲內源的蛋白酶,有效地阻止了蛋白質降解,且不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物作用相同。

綜上所述,本文建立了一種穩(wěn)定高效的靈芝菌絲體總蛋白的提取方法,可滿足靈芝蛋白質組學的定量分析的需要。

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