電子自旋共振法與可見(jiàn)分光光度法對(duì)比測(cè)定葛根黃酮抗氧化性*

李銀花，王海波，李洪燕

1(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州，510520)3(廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州，510110)

葛根，生于荒山山坡、林地邊緣、曠野路邊、溪邊，常纏繞在其他植物上，生長(zhǎng)快，對(duì)氣候及土質(zhì)要求不高，性喜溫暖、潮濕環(huán)境，但亦耐旱［1-3］?，F(xiàn)被國(guó)家衛(wèi)生部列入“藥食兩用”中藥名錄中，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上用之入藥，因富含淀粉，也一直是我國(guó)居民的傳統(tǒng)食品［4-5］。實(shí)驗(yàn)研究證明，葛根中的有效成分為異黃酮類(lèi)化合物，而葛根素是其中的主要成分［7-8］。

電子自旋共振技術(shù)(ESR)是一種新的檢測(cè)物質(zhì)抗氧化性的方法，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)中自由基信號(hào)的改變來(lái)表現(xiàn)自由基的變化［8-9］。本文采用ESR對(duì)葛根黃酮進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)與可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行對(duì)比，探討不同濃度葛根黃酮在質(zhì)量濃度差下對(duì)DPPH·的消除效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根藥材，由廣州二天堂藥店提供，廣東省中藥研究所鑒定為粉葛(P．thomsonii Benth)的干燥根;葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國(guó)Sigma公司;乙醇、甲醇、香蘭素，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A300電子順磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司;752-紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器廠;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、藥典檢驗(yàn)篩 GB6003-95:3號(hào)篩(0．355mm)、電子分析天平，梅斯特-拖利多儀器上海有限公司;電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-SOOB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 樣品制備［10-11］

稱取一定量葛根，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，得葛根粉末。精密取2g葛根粉末，經(jīng)超聲波輔助提取得620．34 mg葛根粗提取物(crude extract purain，CEP)。取定量葛根粗提取物，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，分別用體積分?jǐn)?shù)(下同)30%、60%的乙醇溶液洗脫。將部分60%乙醇洗脫液濃縮，凍干成葛根黃酮粉末，按表1標(biāo)記，置于冰箱4℃中保存，待用。

表1 葛根產(chǎn)品標(biāo)記Table 1 Example of a double column table

1．3．2 葛根黃酮含量測(cè)定-可見(jiàn)分光光度法［12-13］

標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)方法:取30 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶于蒸餾水中，定容至 500 mL，分別從中精密量取2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL，再用蒸餾水定容至 100 mL。以蒸餾水為參比溶液，于250 nm處測(cè)定吸收值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程。

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=0．037 7+84．966x，r=0．993。其中，x，葛根素的濃度(mg/mL);Y，吸光度值;r，線性相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果表明葛根素在0．001 2～0．006 0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1．3．3 ESR 測(cè)定 DPPH·清除率

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig．1 The standard working curve of Puera rin

電子順磁共振波譜儀參數(shù)設(shè)置:溫度25℃;調(diào)制頻率 150．0 kHz;條幅2．1G;時(shí)間常數(shù)330．120 ms;掃場(chǎng)時(shí)間 650．500 s;中心磁場(chǎng) 3 800．00 G;掃場(chǎng)寬度85．00G;X 波段頻率10．124 7 GHz;功率20．000 mW。

用95%乙醇溶液做溶劑，將1．3．1的4個(gè)樣品分別稀釋成10、20、40、60、80 mg/L 溶液，取 1．00 mL 2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液混合，搖勻。將混合液裝入毛細(xì)管中并封閉好，置于電子順磁共振波譜儀諧振腔中，記下波譜圖，計(jì)算波峰面積，用95%的乙醇溶液做出空白試驗(yàn)。

1．3．4 可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)DPPH·清除率

在517 nm處測(cè)定吸光度值，按公式計(jì)算:

A1:依次量取2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液2．00 mL，分別加入 2．00 mL 10、20、40、60、80 mg/L樣品溶液，充分搖勻后，暗置30 min，待測(cè)。

A2:量取蒸餾水 2．00 mL，分別加入 2．00 mL10、20、40、60、80 mg/L 樣品溶液，充分搖勻后，暗置 30 min，待測(cè)。

A3:取 2．00 mL 95%乙醇溶液加入 2．00 mL 2．5×10-4mol/mL DPPH溶液，搖勻測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESR法測(cè)定葛根黃酮自由基清除效果

2．1．1 10 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

10 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進(jìn)樣后0，15，30 min內(nèi)測(cè)得清除 DPPH·波譜圖，如圖2所示。

由圖2與圖3可知，10 mg/L葛根黃酮在電子順磁共振中，自由基特有的吸收波段主要在3 660～3 840 G之間。4份樣品DPPH·的清除率均不高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，清除自由基的能力均有略微的提高，其中60%乙醇洗脫液凍干粉清除DPPH·的能力最強(qiáng)。30 min與15 min處理時(shí)間相比，4份樣品30 min 處理，清除率分別提高了 26．6%，16．7%，8．9%，21．4%。

圖2 10 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普?qǐng)DFig．2 10 mg/L puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

2．1．2 20 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

取20 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進(jìn)樣后0，15，30 min內(nèi)測(cè)得清除DPPH自由基波普?qǐng)D，如圖4、圖5所示。

圖3 10 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．3 10 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖4 20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普?qǐng)DFig．4 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖5 20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．5 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

由圖4和圖5可知，20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH自由基能力有所提高。在反應(yīng)時(shí)間段為15 min，20 mg/L葛根黃酮4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4 分別提高了 20．5%，22．0%，30．4%，40．5%。同樣，60%乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強(qiáng)。2個(gè)時(shí)間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了 36．6%，37．7%，21．9%，31．4%。

2．1．3 40 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

40 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進(jìn)樣后0，15，30 min內(nèi)測(cè)得清除 DPPH·波普?qǐng)D，如圖6、圖7所示。

由圖6和圖7可以看出，在反應(yīng)15 min，40 mg/L葛根黃酮4份樣品CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較20 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了30．5%，33．0%，40．4%，50．5%。同樣，60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強(qiáng)。2個(gè)時(shí)間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了56．6%，57．7%，61．9%，71．4%。

2．1．4 60 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

60 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進(jìn)樣后0，15，30 min內(nèi)測(cè)得清除 DPPH·波普?qǐng)D，如圖8、圖9所示。

由圖8和圖9可以看出，在反應(yīng)時(shí)間段為15 min，60 mg/L葛根黃酮 4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較40 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了 70．5%，63．0%，60．4%，70．5%。2 個(gè)時(shí)間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了66．6%，67．7%，71．9%，81．4%。60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強(qiáng)。在反應(yīng)30 min時(shí)，自由基清除率達(dá)到了95%。

2．1．5 80 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

80 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進(jìn)樣后0，15，30 min內(nèi)測(cè)得清除 DPPH·波普?qǐng)D，如圖10、圖11所示。

圖6 40 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普?qǐng)DFig．6 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖7 40 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．7 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖8 60 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普?qǐng)DFig．8 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

由圖10和圖11可以看出，80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除率均有大幅提高。在反應(yīng)時(shí)間段為15 min，80 mg/L葛根黃酮 4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較60 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了 60．5%，67．0%，70．4%，60．5%。2 個(gè)時(shí)間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了36．6%，37．7%，31．9%，41．4%。60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強(qiáng)。在反應(yīng)30 min時(shí)，自由基清除率幾乎達(dá)到了100%。

圖9 60 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．9 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖10 80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普?qǐng)DFig．10 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖11 80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．11 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

從上述情況來(lái)看，不管在15 min或是30 min，在相同的質(zhì)量濃度下，60%乙醇洗脫液凍干粉CEP4對(duì)自由基的清除率都是最高，由此說(shuō)明了葛根的60%乙醇洗脫液凍干粉對(duì)抗氧化能力最強(qiáng);同時(shí)在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葛根素提取液對(duì)自由基的清除率出現(xiàn)劑量效應(yīng)，在比較低質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)自由基的清除能力比較弱，隨著質(zhì)量濃度的升高，自由基的清除能力也相應(yīng)的提高。當(dāng)質(zhì)量濃度為60 mg/L，對(duì)自由基的清除率出現(xiàn)了大幅度的提高，其平均清除率達(dá)到了90%，其原因主要是在不同提取液中葛根素的含量不同。從反應(yīng)時(shí)間來(lái)看，相同的質(zhì)量濃度，30 min處理時(shí)間對(duì)自由基的清除率均高于15 min的清除率。其主要原因是反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，樣品中的葛根素與自由基沒(méi)能完全進(jìn)行結(jié)合。在反應(yīng)30 min，不夠量的樣品也沒(méi)有辦法將自由基完全清除。而80 mg/L60%乙醇洗脫液凍干粉(CEP4)自由基清除率達(dá)到了100%，自由基清除效果最好。

2.2 可見(jiàn)分光光度法測(cè)定葛根素對(duì)自由基清除率的結(jié)果

圖12 4份葛根樣品對(duì)DPPH·的清除效果圖Fig．12 Samples for four DPPH radical scavenging effect diagram

從圖12中可以知道，可見(jiàn)分光光度法測(cè)定的4種不同葛根素提取液均有清除自由基的能力，同時(shí)樣品質(zhì)量濃度提高對(duì)應(yīng)的自由基清除率也提高，4份樣品對(duì)自由基清除能力大小分別是CEP4＞CEP3＞CEP2＞CEP1，其中60%乙醇洗脫液凍干粉在不同濃度和不同處理時(shí)間上效果最好。分光光度法與ESR法測(cè)得的4份樣品清除率來(lái)比較，相同時(shí)間，相同濃度下，分光光度法普遍低于ESR法測(cè)得的4份樣品清除率。這說(shuō)明ESR更能靈敏地反應(yīng)出葛根素對(duì)自由基的清除能力。

3 結(jié)論

本研究采用了可見(jiàn)分光光度法和電子自旋共振檢測(cè)技術(shù)測(cè)定4份不同葛根素提取液對(duì)DPPH·清除能力的比較，得出葛根素有很強(qiáng)的抗氧化能力。在ESR測(cè)定法里，不同的反應(yīng)時(shí)間，同一份樣品對(duì)DPPH·的清除率和質(zhì)量濃度成正比例關(guān)系，在質(zhì)量濃度為60 mg/L時(shí)，自由基的清除率有顯著的提高。ESR處理時(shí)間30 min，60%乙醇洗脫液葛根凍干粉自由基清除率可以達(dá)到100%。通過(guò)2種方法的比較，表明電子自旋共振檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)自由基清除效果要明顯好于可見(jiàn)分光光度法，ESR法能更靈敏、更準(zhǔn)確地測(cè)定自由基清除效果。

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