Thielavia terrestris產(chǎn)纖維素酶液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化*

余培鎧，劉剛，栗荷天，王娟

(深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳，518060)

尋找快速、高效、穩(wěn)定的纖維素酶是目前生物質(zhì)能源利用領(lǐng)域的一個重要課題。迄今為止纖維素酶已在食品、飼料、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑和造紙等工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用［1］，但纖維素酶大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用的難題仍未得到很好解決。一方面，纖維素酶的產(chǎn)量及酶的比活力低一直制約著纖維素酶的實際應(yīng)用;另一方面，現(xiàn)有的纖維素酶產(chǎn)品大多來源于木霉、青霉、曲霉等中溫菌，在實際利用過程中存在酶的溫度穩(wěn)定性較差和纖維素降解率低這兩大制約因素。耐熱真菌具有適應(yīng)高溫環(huán)境，培養(yǎng)過程不易受常溫微生物的污染等優(yōu)點。其產(chǎn)生的纖維素酶具有較好的熱穩(wěn)定性，較高溫度下能保持較高的降解速度，因此能更好地適應(yīng)工業(yè)中的高溫工作環(huán)境，具有廣泛的應(yīng)用前景［2-4］。

本文對1株嗜熱子囊真菌Thielavia terrestris進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。該菌中含有種類豐富的糖苷水解酶，具有水解生物質(zhì)中多種主要多糖的能力，可產(chǎn)生大量的纖維素降解酶類，其所產(chǎn)酶的最適溫度多在60～80℃，溫度耐受性良好［5-6］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Thielavia terrestris(ATCC38088)，購自美國菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，加水至1 000 mL。

(2)無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基:(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 5 g，加水至1 000 mL。

(3)無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基:CMC-Na 10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，NaCl 5 g，加水至 1 000 mL。

(4)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，加水至1 000 mL，pH 自然(約5.5)。

1.1.3 試劑

3，5-二硝基水楊酸(DNS)、無水亞硫酸鈉、結(jié)晶酚、0.05%檸檬酸鈉緩沖液、定量濾紙等。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化

將低溫保存的原始菌種接種到固體PDA平板，37℃培養(yǎng)7 d。

1.2.2 種子擴培

用無菌水洗下成熟平板上的孢子，調(diào)整孢子濃度為107個/mL，取1 mL接入40 mL種子培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶)中，200 r/min、40℃恒溫振蕩36～48 h，制備成種子液。

1.2.3 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)

按2%接種量吸取800 μL種子培養(yǎng)液到含有40 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，搖床200 r/min、40℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.4 粗酶液提取

用移液器從培養(yǎng)4 d的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中吸取2 mL酶液于1.5 mL離心管，5 000 r/min離心15 min，用檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)進行適當稀釋。于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 濾紙酶活力(FPase)的測定［7-8］

加1.5 mL檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)于試管中，加入濾紙條50 mg(新華定量濾紙，約1 cm×6 cm)，再加入0.5 mL經(jīng)適當稀釋的酶液，50℃水浴保溫1 h，按DNS法測定還原糖。每個樣品設(shè)置對照(同等條件不加濾紙)。酶活定義:在上述條件下，以水解反應(yīng)中1 min催化底物水解形成1 μmoL還原糖所需酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.6 碳氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響

將種子原液以2%接種量分別接種到含有1%不同碳源(CMC-Na、Avicel、濾紙、稻草粉、麥麩、淀粉、葡萄糖、)的無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含有1%的不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、黃豆粉、氯化銨、酵母提取物、硫酸銨)的無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 d，測定其FPase酶活，檢測碳氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.2.7 培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶能力的影響

分別以1%、2%、4%、6%、8%的不同接種量接種于CMC-Na產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，考察接種量對菌株產(chǎn)酶能力的影響;以2%的接種量接種至產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，檢測培養(yǎng)起始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響;以2%的接種量接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置不同培養(yǎng)溫度37、40、45、50、55℃，考察培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響;菌株在上述條件下恒溫搖床培養(yǎng)4 d，分別測定其FPase酶活。以2%的接種量接種到CMC-Na產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔8h取樣進行酶活及菌絲干重的測定，觀察菌株在培養(yǎng)過程中的產(chǎn)酶規(guī)律及菌絲生長情況。

1.2.8 優(yōu)化條件正交設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對產(chǎn)酶活性影響較大的3個主要因素(碳源、氮源、初始pH)，采用正交實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基條件。

1.2.9 粗酶液最適作用條件及溫度穩(wěn)定性的測定

設(shè)置不同pH及反應(yīng)溫度，分別測定粗酶液在不同pH(3.0～9.0)及不同溫度(30～80℃)下的催化活性。

將一定粗酶液分別于不同溫度(60、70、80℃)下，分別恒溫孵育 0、10、20、30、40、50、60 min 后測定剩余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

在不同碳源誘導(dǎo)下菌株的產(chǎn)酶活性具有明顯差異(如圖1所示)。以麥麩為唯一碳源時濾紙酶活(FPase)最高;其次為 Avicel、稻草粉、CMC-Na、濾紙、淀粉。麥麩含有多種復(fù)雜成分，可能作為各種誘導(dǎo)因子，從而對產(chǎn)纖維素酶起到較好的誘導(dǎo)效應(yīng)。以葡萄糖為碳源時酶活最低，分析其原因主要為菌體不需產(chǎn)生纖維素酶即可直接吸收利用葡萄糖，另外，過量的葡萄糖會對纖維素酶的合成產(chǎn)生抑制，即分解代謝物阻遏效應(yīng)。

圖1 碳源對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on cellulase production

2.1.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

不同氮源對產(chǎn)酶誘導(dǎo)的結(jié)果表明，以黃豆餅粉為唯一氮源時酶活最高(見圖2)。黃豆餅粉不僅提供氮元素，還含有鈣、鎂、鉀、磷、鐵等礦物質(zhì)，部分金屬離子可作為纖維素酶的活性基成分或激活劑［14］。其次酶活從高到低的氮源依次為氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏。

圖2 不同氮源對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on cellulase production

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

當培養(yǎng)基起始pH為4.0時，菌株發(fā)酵液酶活達到最高(圖3)。菌株產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為45℃，在40～50℃酶活對溫度的改變表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性，溫度達到55℃以上時，菌體生長十分緩慢，酶活也隨之急劇下降(圖3-B)。接種量對酶活影響的試驗結(jié)果表明，當接種量為6%時酶活到達最高(圖3-C)。菌株生長及產(chǎn)酶受到接種量的影響。接種量不足，不能充分利用發(fā)酵培養(yǎng)基;接種量過多，菌體衰老快，也不利于產(chǎn)酶［10］。不同搖床轉(zhuǎn)速的實驗結(jié)果表明，酶活在轉(zhuǎn)速為200 r/min時為最高。

產(chǎn)酶活性及菌絲生長隨時間變化結(jié)果表明，酶活在48 h即可達到最高(圖3-D)。72 h內(nèi)酶活均比較穩(wěn)定，72 h以后酶活力下降較快，可能由于營養(yǎng)耗盡造成菌體衰老死亡，代謝物積累抑制了菌株產(chǎn)酶;菌絲生長在40～48 h內(nèi)達到頂峰，在這期間菌液顏色變化明顯，呈乳白色，此時細胞快速增長，產(chǎn)酶活性最高;隨后由于發(fā)酵液黏稠度漸漸升高，傳質(zhì)性變差，不利于透氣等導(dǎo)致菌體逐漸衰老死亡。

圖3 不同培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶能力的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on cellulase production

2.3 發(fā)酵條件正交試驗

正交試驗L9(33)設(shè)計(見表1)。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 The design of orthogonal experiment

發(fā)酵過程中3因素對濾紙酶活力的影響能力依次是B＞A ＞C，即氮源對酶活影響最大，其次是碳源，pH在4.0～5.0范圍內(nèi)波動對酶活影響最小。故選擇酶活力最高的培養(yǎng)條件為A2B3C1，即麥麩2.5%，黃豆餅粉2.0%，pH 4.0。

采用優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同時進行產(chǎn)酶實驗，優(yōu)化后所得濾紙酶活得到了顯著提高，可達1.39 U/mL，較優(yōu)化前的0.96 U/mL約提高了44.8%。方差分析顯示，其中氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶活性影響顯著(P＜0.05)(見表3)。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of the Orthogonal Experiment of T.terrestris fermentation

2.4 粗酶的最適作用條件及溫度穩(wěn)定性

圖4 粗酶液的催化性質(zhì)Fig.4 The Catalytic Properties of crude enzyme

粗酶液在不同pH(3.0～9.0)及不同溫度(30～80℃)下的催化活性不同。結(jié)果表明，粗酶液最適作用pH值為6.0，最適作用溫度為60℃。

在不同的溫度條件下恒溫孵育一段時間后，測定其粗酶的FPase活性(圖4)。在60、70、80℃分別孵育60 min，粗酶液酶活分別為原始酶活的82%、76%、63%左右。由此可見，該菌株粗酶液中的纖維素酶在60～80℃下具有較好的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

T.terrestris可合成并分泌種類豐富的木質(zhì)纖維素降解酶類［11］，其所產(chǎn)酶具有較強的熱穩(wěn)定性。本文對T.terrestris(ATCC38088)菌株產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，確定了其最佳培養(yǎng)條件。在單因素實驗中，麩皮能顯著提高濾紙酶活力，可能由于它含有促進微生物生長和產(chǎn)酶的因子，且能吸收水分保持濕潤，故可用麥麩作為該菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳誘導(dǎo)物。黃豆餅粉含有豐富的營養(yǎng)成分，能使菌體迅速生長，酶活力高于其他氮源，故可作為最佳氮源。優(yōu)化過程中，除了接種量外，接種液的狀態(tài)對酶活也會產(chǎn)生明顯的影響，這可能是由于菌體的生長形態(tài)(絲狀或球狀)的不同導(dǎo)致。

優(yōu)化前采用CMC-Na產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后確定以2.5%的麥麩、2.0%的黃豆餅粉，初始pH值為4.0為最佳產(chǎn)酶條件，測得濾紙酶活較優(yōu)化前提高了44.8%，達到了1.39 U/mL。同時該菌株所產(chǎn)酶在60～80℃仍保持較好的熱穩(wěn)定性，如果通過進一步的研究和改造，該菌將成為有應(yīng)用潛力的工業(yè)菌株。

［1］ 湯斌，陳阿娜，張慶慶.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(6):6-8.

［2］ 魏艷紅，熊鷹，袁永澤.纖維素酶產(chǎn)生菌HS-F9的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16(2):274-278.

［3］ Wood TM，Maccpae SI.In bioconversion of cellulose substance into energy，chemicals and microbial protein［M］.Ghose T K ed.Indian Institute of Technology，New Delhi，India，1978:111-141.

［4］ Bruins M.E，Janssen A.E，Boom R.M.The IT I1ozymes and their applications:a review of recent literature and patentsr［J］.Appl Biochem Biotechno1，2001，90(2):155-186.

［5］ 趙春青，李多川.嗜熱子囊菌兩個中國新記錄種［J］.菌物研究，2005，3(1):27-29.

［6］ Berka RM，Grigoriev IV，Otillar R，et al.Comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris［J］.Nat Biotechnol，2011，29(10):922-927.

［7］ Ghose T.Measurement of Cellulase Activities［J］.Pure Appl Chem，1987，58(2):257-268.

［8］ 陸晨，陳介南，王義強.纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測定［J］.印染助劑，2002，5(19):51-53.

［9］ 張洪鑫，陳小泉，蔣玲玲.金屬離子對纖維素酶內(nèi)切酶和外切酶活性的影響［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2011，19(4):6-13.

［10］ 闞國仕，陳春，陳紅漫.綠色木霉95 106固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化研究［J］.中國釀造，2011，12(23):130-133.

［11］ James A.Langston，Kimberly Brown，F(xiàn)eng Xu.Cloning，expression，and characterization of a cellobiose dehydrogenase from Thielavia terrestris induced under cellulose growth conditions［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1824(2012)802-812.