5株發(fā)酵劑對(duì)熏馬腸成熟過(guò)程中內(nèi)源菌的影響*

李蕊婷，盧士玲，李開(kāi)雄，馬宇霞，鄧紅梅

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

目前，肉制品的發(fā)酵劑研究在我國(guó)屬于一個(gè)比較熱門(mén)的領(lǐng)域。在肉制品成熟的過(guò)程中添加合適的發(fā)酵劑，對(duì)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵肉工業(yè)化生產(chǎn)，縮短產(chǎn)品成熟期，對(duì)使產(chǎn)品特征標(biāo)準(zhǔn)化和安全化將起重要的作用［1］。但是隨著肉制品的發(fā)酵和成熟，其內(nèi)源菌群不斷變化，加入不同的發(fā)酵劑可能對(duì)內(nèi)源菌群產(chǎn)生一定影響(拮抗或協(xié)同)。本研究在不采取化學(xué)添加物的前提下，在熏馬腸生產(chǎn)過(guò)程中添加有抑菌作用并可產(chǎn)生物胺氧化酶的菌株作發(fā)酵劑，以不同的添加組合，采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)酵劑對(duì)內(nèi)源微生物在熏馬腸發(fā)酵和成熟過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的影響，為熏馬腸安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與主要試劑

1.1 試驗(yàn)材料

馬肉及其他輔料均購(gòu)自石河子愛(ài)家超市。

發(fā)酵劑:本實(shí)驗(yàn)室分離提取到的4株葡萄球菌和1株植物乳桿菌(Staphylococcus epidermidis;Staphylococcussimulans.001;Staphylococcussimulans.002;Staphylococcus simulans.003;Lactobacillus plantarum)注:Staphylococcus simulans有3個(gè)不同種，分別編號(hào)為 001、002、003。

1.2 主要儀器和試劑

恒溫恒濕培養(yǎng)箱，德國(guó) BINDER公司;灌腸機(jī)(MM12型絞肉機(jī));海爾冰箱;電子天平;高速離心機(jī);小型離心機(jī)(Anke TLG-16G);超凈工作臺(tái)(SWCF-1F);PCR儀，美國(guó) Bio-Rad公司;DGGE電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像儀(GelDoc 2000 system Bio-Rad，美國(guó));微型振蕩器;海爾控溫冰箱;Eppendorf移液槍(1 ～10μL、1 ～20 μL、20 ～ 200 μL、10 ～1 000 μL)。

細(xì)菌總DNA提取試劑盒(天根);溶菌酶(sigma);PCR相關(guān)試劑盒，MarkⅢ，去離子水，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺(Sigma)，尿素(Sigma)，TRIS(Sigma)，EDTA-2Na(Sigma)，TE(Sigma)，過(guò)硫酸銨(Sigma)，SYBR Green I(Bio-V)。

2 試驗(yàn)內(nèi)容及方法

2.1 熏馬腸基本加工工藝

原料肉進(jìn)行處理，將肥膘(20%)切丁進(jìn)行漂洗(40℃)，瘦肉(80%)絞肉，混合腌制接種發(fā)酵劑;灌入腸衣發(fā)酵2 d，(發(fā)酵條件:18 ±0.5℃，RH 90% ～95%);成熟過(guò)程控制不同條件3～4 d［(14±0.5)℃，RH 80% ～85%］，5 ～7 d［(12 ± 0.5)℃，RH 75% ～80%］，8 ～28 d［(10 ± 0.5)℃，RH 70% ～75%］。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照熏馬腸的加工工藝，利用分離純化得到的4株葡萄球菌及1株植物乳桿菌，制作9種不同類(lèi)型熏馬腸(見(jiàn)表1)，其中發(fā)酵劑的接種量為107CFU/g，復(fù)合發(fā)酵劑以1∶1添加。在熏馬腸的發(fā)酵和成熟的過(guò)程中，分別對(duì) 9 組熏馬腸 A、B、C、D、E、F、G、H、I于0、2、7、14、28 d 進(jìn)行無(wú)菌取樣并冷凍保藏，分別對(duì)其進(jìn)行菌相測(cè)定。

表1 接種不同發(fā)酵劑類(lèi)型的熏馬腸Table 1 The smoked horsemeat sausage of inoculating with different starter culture

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 細(xì)菌總DNA的提取

取待測(cè)樣品20g于180 mL生理鹽水中，搖床振蕩30 min;4 000重力加速度的條件下4℃離心10 min;再取上清液1 mL于1.5 mL離心管在10 000重力加速度條件下4℃離心10 min，棄去上清液，反復(fù)幾次。參照DNA提取試劑盒(天根)的說(shuō)明，提取樣品總細(xì)菌的DNA。所提取的DNA溶于TE緩沖液，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于-20℃條件下貯藏以備PCR擴(kuò)增使用。

2.3.2 PCR擴(kuò)增

所選用的引物為［2］:上游引物為帶GC夾子的U968(5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3＇)，下游引物為 L1401(5＇-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)。對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的 V6-V8區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段為400bp。

PCR 反應(yīng)為25 μL體系:包括1μL模板DNA，上游引物和下游引物各0.5μL，HS MIX(東盛)12.5μL，無(wú)菌水10.5μL。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min，35個(gè)循環(huán)(95℃變性30s;56℃退火30s;72℃延伸30s)，最終72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃冰箱保存以備DGGE使用。

2.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DGGE采用Bio-rad電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺37.5:1)。變性梯度為40%～60%(40%變性劑凝膠溶液:9.6 mL 0%變性劑+14.4 mL 100%變性劑 +50μL 20%APS溶液+5μL TEMED;60%變性劑凝膠溶液:14.4 mL 0%變性劑 +9.6 mL 100%變性劑 +50μL 20%APS溶液 +5μL TEMED)，濃縮膠為:6 mL 0%變性劑 +30μL 20%APS溶液 +6μL TEMED。在 pH 為7.4的1×TAE緩沖液中，將PCR產(chǎn)物加入膠孔，溫度設(shè)定為60℃，然后開(kāi)始電泳，電泳條件為:200V電壓預(yù)跑10 min，之后85V電壓16 h。

2.3.4 SYBR Green I染色

待電泳結(jié)束后，小心取下膠片，放入50 mL pH為7.0～8.5的1×TAE(含5μL SYBR Green I)中室溫避光振蕩染色30 min，之后再將膠片放入超純水中漂洗幾次。

2.3.5 凝膠成像及DNA的回收

待染色后，小心地將DGGE膠片轉(zhuǎn)移到凝膠成像系統(tǒng)下拍照并割膠(要盡快操作，否則在紫外光的作用下，很快圖像的效果就會(huì)降低)，圖像分析采用Quantity one軟件。割膠回收是用無(wú)菌手術(shù)刀切下DGGE膠上相應(yīng)位置的條帶，分別放入已經(jīng)滅菌的1.5 mL離心管里，加入20μL無(wú)菌的TE溶液，置于4℃條件下過(guò)夜以備DNA測(cè)序的使用。

2.3.6 DNA的測(cè)序

取2μL回收的DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的V6-V8區(qū)域擴(kuò)增，細(xì)菌上游引物為U968(5＇-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3＇)，下游引物 L1401(5＇-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)，PCR 擴(kuò)增程序同2.3.2。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，條帶的位置在400bp就可以證明該回收DNA的存在，之后將剩余PCR產(chǎn)物送到華大基因測(cè)序，登錄NCBI將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)［3］。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌總DNA提取結(jié)果

選取9組不同處理的樣品，分別在其成熟過(guò)程中第0，2，7，14，28天的取樣。用細(xì)菌總 DNA 提取試劑盒，對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)菌操作并提取樣品中的總DNA，之后將溶于TE緩沖液的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到明顯的條帶，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)樣品的細(xì)菌總DNA提取效果很好，提取方法合適，所得到總DNA適合后續(xù)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

3.2 細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增

以不同處理的熏馬腸細(xì)菌總DNA為模板，用引物GC-U968和L1401對(duì)16S rDNA的V6-V8可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得約400bp的特異性片段，所有樣品均有較亮的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增條件是適合的，可以滿(mǎn)足后續(xù)DGGE電泳分析實(shí)驗(yàn)的條件。

3.3 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列相似性比較

由圖1和圖2可看出，因2張圖中均有對(duì)照組A，將2張圖片進(jìn)行位置比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)圖2中條帶在圖1中有相互對(duì)應(yīng)的條帶。DGGE指紋圖上的1個(gè)條帶就代表1個(gè)微生物類(lèi)群，因此，圖2中部分條帶割膠后沒(méi)有進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)比對(duì)后，對(duì)應(yīng)的位置為:m1→M1，m2→M2，m3→M3，m4→M6，m6→M8，m7→M9，m8→M10，m10→M11，m11→M13，m12→M14，m13→M15。其他 M4，M5，M7，M12，m5，m9 沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的條帶。

圖1 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.1 DGGE fingerprinting of PCR products of smoked horsemeat sausage during ripening

3.4 細(xì)菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列分析

通過(guò)PCR-DGGE電泳照相后，把條帶割膠用不帶GC夾子的引物擴(kuò)增序列(同2.3.6)后，其中m9和M12于條帶太弱，菌活力弱，菌液中濃度過(guò)低，沒(méi)有測(cè)出相應(yīng)的序列，其余可進(jìn)行后續(xù)分析。將測(cè)序結(jié)果與Gene bank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，確定結(jié)果(見(jiàn)表2)。

圖2 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.2 DGGE fingerprinting of PCR products of smoked horsemeat sausage during ripening

表2 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜上條帶系列分析(圖1中的條帶)Table 2 Identities of bands obtained from DGGE analysis of bactrial communities in smoked horsemeat sausage during ripening(bands obtained from Fig.1)

4 討論

如圖1、圖2可看出，空白組第14天的菌相最豐富，且數(shù)量最大，第0天使M1、M2數(shù)量多，其他的菌濃度都低。第2天時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，菌相開(kāi)始豐富，M6、M7、M8、M9、M10 均出現(xiàn)。第 7 天時(shí)，種類(lèi)基本無(wú)變化，數(shù)量增多。第14天時(shí)，M10消失，出現(xiàn)M13、M14。第28天時(shí)，菌數(shù)量減少，菌群達(dá)到動(dòng)態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)，M1、M2為自然發(fā)酵劑，且一直是優(yōu)勢(shì)菌種，幾乎不受添加發(fā)酵劑的影響。M9為植物乳桿菌，在C、E、G、I四組復(fù)合添加植物乳桿菌中，數(shù)量比不復(fù)合的相應(yīng)組數(shù)量要多，同時(shí)其他條帶的亮度也都降低，說(shuō)明此株植物乳桿菌能夠在一定程度上抑制內(nèi)源菌的生長(zhǎng)。

B組和C組中，M3、M9為發(fā)酵劑，B組中M3隨著發(fā)酵時(shí)間的增加越來(lái)越少，C組中M3增強(qiáng)，2組中的M9數(shù)量越來(lái)越大。與空白組對(duì)照，增加了內(nèi)源菌的生長(zhǎng);D組和E組中，M4、M9為加入的發(fā)酵劑，D組中M4一直未變，M9逐步增多，內(nèi)源菌增多。E組中M4越來(lái)越少，M9到第2天時(shí)增多后又下降。E組的發(fā)酵劑的內(nèi)源菌的數(shù)量減少，種類(lèi)變多;F組和G組中，m4、m7為發(fā)酵劑，2組的M7都逐漸增多，F(xiàn)組中的m4增大到28 d時(shí)降低且穩(wěn)定，G組的m4持續(xù)增多。內(nèi)源菌的種類(lèi)和數(shù)量都降低;H組和I組中，m5、m7為發(fā)酵劑，m5在0 d時(shí)出現(xiàn)，后被抑制。m7越來(lái)越多，發(fā)酵結(jié)束后并沒(méi)有明顯影響內(nèi)源菌的種類(lèi)和數(shù)量。

在熏馬腸中，實(shí)際菌相可能比檢測(cè)到的更加復(fù)雜，存在一些在本研究過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到的其他屬菌或乳酸菌、腸細(xì)菌、微球菌和假單胞菌屬中的其他種類(lèi)。在很多相關(guān)的報(bào)道中，對(duì)主要腐敗菌進(jìn)行初步分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonas sp.)是主要的腐敗優(yōu)勢(shì)菌之一［4-5］。有研究表明，當(dāng)該種微生物占整個(gè)微生物種群數(shù)小于1%時(shí)，DGGE將檢測(cè)不到該種微生物的存在［6］。

研究表明，糞腸球菌、屎腸球菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌可產(chǎn)生大量的生物胺［7］，一些乳酸菌也可產(chǎn)生生物胺［8］，控制它們的生長(zhǎng)能夠更好的保障發(fā)酵香腸的品質(zhì)。Cocolin等人［9］將DGGE用于自然發(fā)酵意大利香腸成熟過(guò)程中菌相的分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳酸菌是其香腸發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，其中 Lactobacillus sake和 Lactobacillus curvatus對(duì)產(chǎn)品的酸化和蛋白質(zhì)的水解有重要作用，決定了發(fā)酵香腸的感官質(zhì)量。在本研究中，Weissella sp.是優(yōu)勢(shì)菌，但Weissella sp.不產(chǎn)生物胺已經(jīng)得到證實(shí)［10］;微球菌屬中的一些菌也能產(chǎn)生生物胺，但產(chǎn)生物胺的能力極其有限［11］，它們的存在對(duì)香腸的品質(zhì)影響不明顯。

5 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)PCR-DGGE的方法揭示了熏馬腸成熟過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌相的變化。結(jié)果表明，添加不同發(fā)酵劑的熏馬腸菌相分布呈現(xiàn)不同變化，但是隨著成熟時(shí)間的變化，優(yōu)勢(shì)菌趨于明顯。添加發(fā)酵劑所有組合對(duì)內(nèi)源菌Escherichia coli有較強(qiáng)的抑制作用;腐敗菌條帶 M8，M10，M13，M14從成熟初期到結(jié)束一直存在，添加發(fā)酵劑所有組合對(duì)內(nèi)源菌Escherichia coli有較強(qiáng)的抑制作用;其中C，D，E組中細(xì)菌種類(lèi)在發(fā)酵初期較多，但到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其菌含量下降，尤其對(duì)內(nèi)源菌 Pseudomonas sp.，Staphylococcus carnosus和Staphylococcus xylosus有較強(qiáng)抑制作用;G組中內(nèi)源的Pseudomonas sp.一直存在;與E組對(duì)應(yīng)的添加單一發(fā)酵劑的D組在發(fā)酵初期并沒(méi)有E組的微生物種類(lèi)多，但其抑菌效果較好;內(nèi)源的Weissella sp.和Staphylococcus sp.在成熟過(guò)程中一直存在，不受發(fā)酵劑的抑制，但Weissella sp.不產(chǎn)生物胺。F組在28 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌群的種類(lèi)和數(shù)量為最低，抑菌效果最好。

［1］ 賈士芳，陳美玲，鐘瑾，等.肉制品發(fā)酵劑木糖葡萄球菌I2的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(8):72-74.

［2］ Ercolini D.PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56(3):297-314.

［3］ Altschul S F，Madden T L，Schaffer A A，et al.Gapped BLAST and PSIBLAST:a new generation of protein database search programs ［J］.Nucleic Acidas Research，1997，25(17):3 389-3 402.

［4］ Ols son C，Ahrné S，Pettersson B，et al.The bacterial flora of fresh and chill-stored pork:analysis by cloning and sequencing of 16S rRNA genes［J］.International Journal of Food Microbiology，2003，83(3):245-252.

［5］ Gill C O，Dus sault F，Holley R A A，et al.Evaluation of the hygienic perform ances of the processes for cleaning，dressing and cooling pig carcasses at eight packing plants［J］.International Journal of Food Microbiology，2000，58(1-2):65-72.

［6］ Muyzer G，E C de Waa，Uitterlinden A G.Profiling of comples microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rDNA［J］.Appl Environ Microbial，1993，59(3):695-700.

［7］ 盧士玲，樊慶魯，李開(kāi)雄.豬肉自然發(fā)酵香腸中細(xì)菌和乳酸菌對(duì)生物胺積累的作用［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(2):37-40.

［8］ Montel M C，F(xiàn).M，R.T.Comparison of biogenic amine content in traditional and industrial French dry sausages［J］.Sciences des Aliments，1999，19(2):247-254.

［9］ Cocolin L，Manzano M，Cantoni C，et al.Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of the 16S rRNA gene V1 region to Monitor dynamic changes in the bacterial population during fermentation of Italian sausages［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67(11):5 113-5 121.

［10］ Bover-Cid S，Holzapfel W H.Improved screening procedure for biogenic amines production by lactic acid bacteria［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，53(1):33-41.

［11］ Martuscelli M，Gardini F，Torriani S，et al.Production of biogenic amines during the ripening of Pecorino Abruzzese cheese［J］.International Dairy Journal，2005，15(6-9):571-578.