海紅果多糖水提醇沉工藝及其抑菌活性研究*

吳敬，王英麗，寶冠媛，郭海燕，李麗杰，王越男

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

海紅果，學名西府海棠(Malus micromalus Makino)又名海紅、海紅子、子母海棠、小果海棠，屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)蘋果屬［1-2］，主要分布在我國的蒙晉陜?nèi)?區(qū))省交界的黃土丘陵溝壑地區(qū)［3］。海紅果營養(yǎng)豐富，除含有基本的營養(yǎng)成分外，還含有16種氨基酸，其中富含纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸及嬰幼兒生長必要的組氨酸、精氨酸，且鈣的含量居于水果之冠，素有“鈣王”之美譽［3-4］。近年來市場上出現(xiàn)的以海紅果為主要原料的保健制品，已被證明在補鈣、補鋅、促進大腦發(fā)育、軟化血管、降低血脂有較好作用，有些地區(qū)甚至以海紅代替山楂入藥［3-4］，這些都為其開發(fā)奠定了良好理論基礎。

近些年，植物多糖的多種生物活性包括抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗輻射、抗突變、降血糖、增強免疫等［6-7］已被證實。郝志鵬等研究表明海紅果多糖(PFM)有較強的抗氧化能力［8］。為了進一步研究海紅果多糖的功效，本文對海紅果多糖的醇沉工藝進行研究，并探討其對蠟樣芽孢桿菌CGMCC1.1686、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌效果，以期為海紅果的綜合利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

海紅果:秋季摘果，洗凈、陰干、粉碎后過60目篩，干燥貯存，備用;苯酚，葡萄糖，濃硫酸，無水乙醇，均為分析純;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基，胰酪胨蛋白胨培養(yǎng)基，參照文獻配制［9-10］。

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cerecus CGMCC1.1686)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26112)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus CMCC(B)28001)、大 腸 桿 菌 (Escherichiacoli ATCC25922)、沙門氏菌(Salmonella typhimuniuns)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes CMCC54002)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室提供。

1.2 試驗儀器與設備

T6-新銳可見分光光度計，美國惠普公司;AL204型電子分析天平(十萬分之一)，梅特勒-托利多儀器公司;TG-16-WS型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;HH.S 1-Ni型電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠;DHG-9075A型真空干燥箱，上海-恒科學有限公司;LTI-601SD型恒溫培養(yǎng)箱，東京理化器械株式會社;XC189-HY-08小型高速粉碎機，西化儀(北京)科技有限公司HY-08。

1.3 實驗方法

1.3.1 水提醇沉法提取海紅果多糖(PFM)

精確稱取樣品粉末1.00 g，加入10倍體積的無水乙醇浸泡24 h后，離心，濾渣加入一定體積的蒸餾水，回流提取2次，抽濾，合并濾液后再離心(10 000 r/min，15 min)，加入95%的乙醇，使多糖液的含醇量為80%，在冰箱中醇沉12 h。將沉淀溶液在20℃下以10 000 r/min離心15 min，離心后棄上清液，沉淀再分別用無水乙醇和80%的乙醇洗滌2次，離心后棄去上清液，即得海紅果粗多糖粗品，備用。

1.3.2 PFM提取的單因素和正交試驗

利用回流提取技術(shù)，分別考察提取溫度、料液比、提取時間及醇沉比對提取樣品中多糖含量的影響。試驗料液比選取 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 五個水平，提取時間選取 30、60、90、120、150 min 五個水平，提取溫度選取 75、80、85、90、95℃ 五個水平，醇沉濃度選取60%、70%、80%、90%、99.9%四個水平，分別進行單因素試驗，重復3次。在單因素試驗基礎上，選出適宜的提取溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度進行正交試驗。

1.3.3 PFM 含量測定

以葡萄糖為對照品，采用改良的苯酚-硫酸顯色法測定總多糖含量［8，11］。

具體方法:精密吸取葡萄糖工作液(0.1 mg/mL)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，各加蒸餾水至 2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，混合搖勻，室溫放置10 min，然后置沸水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫。在波長490 nm處測吸光度，空白對照是以蒸餾水代替葡萄糖溶液。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線。葡萄糖標準曲線方程:y=0.1556x-0.0362(R2=0.9966)。根據(jù)標準曲線計算粗多糖含量:

式中:C待為待測樣的濃度，mg/mL;m樣為待測樣的質(zhì)量，g。

1.3.4 PFM 的抑菌試驗

(1)菌懸液的制備［12-14］:將實驗細菌分別接種于營養(yǎng)肉湯液體液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，以2%的接種量再活化1代，用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋，制成106CFU/mL菌懸液，冰箱4℃保存待用。

(2)抑菌試驗:稱取PFM 7.5 g，用無菌水配制成質(zhì)量濃度為75 mg/mL的PFM溶液。將此多糖溶液分別稀釋成 50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL 系列質(zhì)量濃度溶液。

采用雙層瓊脂平板擴散法檢測抑菌活性。即在滅菌平皿內(nèi)倒入10 mL的滅菌水瓊脂，使其鋪滿平板底部。待平板內(nèi)培養(yǎng)基冷卻凝固后，放入牛津杯;取含菌約106CFU/mL的指示菌懸液200 μL加入到軟瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后傾注到滅菌的平皿內(nèi)，待培養(yǎng)基凝固后，取出牛津杯，在孔中加200 μL海紅果多糖溶液，室溫擴散3～5 h，37℃培養(yǎng)18 h，同時以無菌水為陰性對照，每種質(zhì)量濃度做3次重復。用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，讀數(shù)精確至0.01 mm。判定標準抑菌環(huán)直徑大于8.1 mm者判為有抑菌作用，抑菌環(huán)小于或等于8 mm者判為無抑菌作用［13］。陰性對照組應無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗無效。

2 結(jié)果與分析

2.1 海紅果粗多糖回流提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對多糖提取的影響

在提取時間60 min，提取溫度90℃的條件下，考察料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 對多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 料液比對多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of PFM

由圖1可看出，在料液比1∶10～1∶30范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，多糖提取量明顯上升，這是由于料液比越大，海紅果細胞內(nèi)外的多糖濃度差就越大，溶質(zhì)的擴散動力增加，傳質(zhì)推動力大則利于多糖的浸出;當料液比達1∶25時，多糖已基本溶出，繼續(xù)增加料液比，多糖含量增加不明顯，且會增加雜質(zhì)的浸出率，也會增加后續(xù)加工成本。綜合考慮各方因素，提取以料液比1∶20 ～1∶30 為宜。

2.1.2 提取時間對多糖提取的影響

在料液比為1∶30，提取溫度90℃的條件下，分別考察提取時間為30、60、90、120、150 min 對多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出，提取時間為30～90 min時，多糖提取量隨時間延長而增大，但90 min后隨著提取時間的延長而降低。這是因為隨著提取時間的延長，部分多糖降解為單糖、寡糖或低聚糖，它們可溶于乙醇，在醇沉過程中有所損失，故提取率下降。因此，提取時間以30 min為宜。

圖2 提取時間對多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of PFM

2.1.3 提取溫度對多糖提取的影響

在料液比為1∶30，提取30 min，分別考察溫度為75、80、85、90、95 ℃ 對多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 提取溫度對多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of PFM

由圖3可以看出，溫度是影響多糖提取的關(guān)鍵因素之一，在75～85℃，海紅果多糖含量隨溫度的升高而增加。這是因為隨著提取溫度的升高，樣液黏度降低，組織中的多糖向提取液中的傳質(zhì)速率增加，有利于組織中的多糖浸出。當溫度高于85℃，海紅果多糖含量開始下降，這是因為多糖的熱穩(wěn)定性下降，導致多糖分解。因此，將提取溫度確定為80～90℃。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對多糖提取的影響

在提取次數(shù)為1次，料液比為1∶30，提取時間為30 min，提取溫度為85℃的條件下，分別考察乙醇體積分數(shù)分別為60%、70%、80%、90%、99.9%對多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，海紅果多糖提取量隨乙醇體積分數(shù)的增加而增加，在使用60%體積分數(shù)的乙醇沉淀時，多糖的得率相對較低;用70%體積分數(shù)的乙醇沉淀時，多糖的提取量有所提高;而用80%體積分數(shù)以上的乙醇沉淀時，樣品中的多糖提取量顯著增加。其原因可能是在低濃度乙醇沉淀時，沉淀下來的可能主要是高分子量的多糖;中等體積分數(shù)乙醇沉淀下來的可能是中等分子量的多糖［15］。綜合考慮多種因素，選擇最適乙醇體積分數(shù)為80% ～99.9%。

圖4 乙醇體積分數(shù)對多糖提取的影響Fig.4 Effect of alcohol concentration on extraction yield of PFM

2.2 海紅果多糖提取的正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)上述單因素的試驗結(jié)果進行正交試驗，各因素水平的選取及結(jié)果見表1。

表1 海紅果多糖的L9(34)正交試驗結(jié)果Table 1 The results of the orthogonal experiment of PFM

根據(jù)極差分析法，由表1中的試驗結(jié)果可知，本試驗中4個影響因素(料液比，時間，溫度，醇沉濃度)對多糖含量影響的順序為:RA＞RC＞RB＞RD，即A因素(料液比)為最重要的因素，其次為C因素(提取溫度)和B因素(提取時間)，D因素(乙醇濃度)影響最小。最優(yōu)試驗條件的組合是A2C3B2D1，即料液比1∶25，提取溫度為90℃，提取時間60 min，乙醇體積分數(shù)80%。與單一影響因素相比，使用復合影響因素(A2C3B2D1)所得多糖的提取量較高。以正交試驗所確定的最優(yōu)水平組合做驗證試驗，PFM含量為105.15 mg/g。

2.3 海紅果多糖抑菌試驗結(jié)果

采用雙層瓊脂平板擴散法研究海紅果多糖對B.cerecus CGMCC1.1686、Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、E.coli ATCC25922)、Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002、S.aureus ATCC25923八種試驗菌的抑制效果，以抑菌圈直徑的大小為衡量指標，試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，海紅果多糖在濃度75 mg/mL和50 mg/mL 時對 B.cerecus CGMCC1.1686、Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002 均有抑菌作用，在濃度25 mg/mL時僅對Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002有抑菌性，而且，多糖濃度越小，抑菌效果越弱。除上述菌外，海紅果多糖濃度在75 mg/mL以下時，均對Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、MicrococcusluteusCMCC(B)28001、 E. coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923、Saccharomyces cerevisiae無抑菌作用。

表2 海紅果多糖抑菌結(jié)果Table 2 Antimicrobial results of PFM

3 結(jié)論

本實驗通過3水平4因素正交試驗，確定了提取海紅果多糖的最佳工藝條件，即為:料液比1∶25(g∶mL)，提取溫度90℃，提取時間 60 min，乙醇濃度80%，在此條件下多糖含量105.15 mg/g。4個單因素對多糖含量的影響順序為:料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度。

通過抑菌試驗表明，海紅果多糖僅對B.cerecus CGMCC1.1686、Salmonella typhimuniuns、L.monocytogenes CMCC54002有良好的抑菌作用，且對3株菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為50 mg/mL、25 mg/mL、25 mg/mL;對 Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、E.coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923、Saccharomyces cerevisiae無抑菌作用。其具體原因和作用機制需要在今后的研究中繼續(xù)探索。

［1］ 趙亮，李青山.紫外分光光度法測定海紅果中總黃酮的含量［J］.山西醫(yī)科大學學報，2006(2):169-171.

［2］ 王瑋.海紅果醋加工技術(shù)的研究［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2011:1.

［3］ 吳彩萍，羅茂珍，等.偏關(guān)海紅果［J］.山西果樹，2003(3):21-23.

［4］ 王永熙，白與年.府谷海紅子［J］.果樹科學，1995，12(增刊):153-154.

［5］ 李爾春.天然植物多糖的結(jié)構(gòu)及活性研究進展［J］.食品與藥品，2007，9(4):51-52.

［6］ GANG Xiang，DAN Wang，ZOU Gui-Hua.Optimized Ultrasonic-Assisted Extraction of Polysaccharides from Chinese Traditional Medicinal Plant Paris fargesii Using Orthogonal Design［J］.Journal of Applied Pharmaceutical Science，2013，3(5):110-113.

［7］ 謝明勇，聶少平.天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進展［J］.中國食品學報，2010，10(2):1-9.

［8］ 郝志鵬，馬麗杰，吳敬.海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究［J］.食品科學，2012，33(18):88-92.

［9］ 陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應用［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1995:234.

［10］ 沈萍，范秀容，李光武.微生物學實驗［M］.3版.北京:高等教育出版社，1999:49-97.

［11］ 董群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究［J］.中國藥學雜志，1996，31(9):550-553.

［12］ 劉安軍，王玥瑋，朱振元，等.核桃仁種皮多糖的提取及抑菌作用的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，6(4):362-369.

［13］ 吳敬.酸馬奶中屎腸球菌MKB64細菌素特性及其相關(guān)基因的研究［D］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2011:29.

［14］ 張百剛，鐘旭美，劉曉風.甘草多糖的提取及其抑菌試驗的研究［J］.糧油加工，2010(8):137-140.

［15］ 金麗梅，劉偉，湯一哲.水提醇沉法玉米須多糖提取工藝研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2007，19(5):62-66.