基于文獻的畢赤酵母研究趨勢分析*

張建國，傅夢月

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海，200093)

畢赤酵母是一種能利用甲醇為碳源的甲基營養(yǎng)型微生物［1］。經過幾十年的研究，它已經是藥物蛋白、酶及積累代謝中間體的熱門來源之一［2-5］。畢赤酵母高密度發(fā)酵后細胞干重達到130 g/L［6］，適用于單細胞蛋白的生產。此外，它富含甲硫氨酸、色氨酸等高附加值營養(yǎng)物質。畢赤酵母以過氧化物酶體中3個酶(醇氧化酶、二羥丙酮合成酶、甲醛脫氫酶)代謝甲醇，畢赤酵母過氧化物酶體中含有2個醇氧化酶(AOX1、AOX2)。由于醇氧化酶與甲醇結合的親和力弱，所以醇氧化酶在畢赤酵母中含量可達35%［7］。將外源基因導入醇氧化酶表達機制將大幅度提高外源蛋白質的生產效率。研究人員通過對畢赤酵母生化特性的研究，闡明了代謝甲醇的多個酶的基因和蛋白質結構，建立了較為全面的培養(yǎng)方法和基因操作方法。畢赤酵母的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法簡單，沒有Crabtree效應，具有高底物利用效率［8］。隨著畢赤酵母的基因組測序完成，很多學者試圖建立代謝網(wǎng)絡，優(yōu)化表達外源蛋白的代謝控制。截至目前已有超過600多種不同來源的外源基因在畢赤酵母中成功表達，多種外源蛋白作為工業(yè)用酶和蛋白藥物已經商業(yè)化［9］。本文從文獻的角度敘述了畢赤酵母的研究趨勢，展示了我國畢赤酵母研究所處的位置，分析了研究動向。

1 研究數(shù)據(jù)來源

本文以Web of Knowledge數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，以pastoris為關鍵詞搜索相關文獻，再將文獻下載到Endnote文獻管理軟件后進行分析，手工剔除數(shù)據(jù)庫中Capsella bursa pastoris等文獻及數(shù)據(jù)庫中重復收錄的文獻。檢索的時間截至2014年3月7日，共得到相關文獻3 270篇。其中沒有收錄最早發(fā)現(xiàn)畢赤酵母可以利用甲醇為唯一碳源的文獻［1］。

國內文獻研究以維普中文數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源。以“畢赤酵母”為關鍵詞搜索后進行手工剔除，共得到近10年文獻1 437篇。

2 文獻檢索結果與分析

2.1 研究畢赤酵母的文獻隨時間的變化

Web of Knowledge數(shù)據(jù)庫中最早收錄的畢赤酵母文獻是1975年Hazeu報道對畢赤酵母代謝甲醇細胞器的觀察。其他相關文獻在1985年Cregg將畢赤酵母用于外源基因的表達后數(shù)量逐步增加，尤其是1994年以后文獻數(shù)目呈直線上升趨勢(圖1)。2013年發(fā)表的文獻達到293篇，說明近年來有關畢赤酵母的研究正在擴張。

2.2 文獻種類的組成

從文獻類型的組成來看(圖2)，數(shù)量最多的文獻是研究論文，占79.20%。說明關于畢赤酵母技術和應用的研究仍占多數(shù)。然后依次是專利(11.99%)、會議論文(2.69%)、綜述論文(1.56%)、書籍的章節(jié)(0.12%)，其他文獻占4.43%。除研究論文外，專利是數(shù)量最多的文獻，說明研究人員認為有關畢赤酵母的研究內容具有很大應用潛力。

2.3 文獻量前10名的國家及其每篇文獻平均引用數(shù)

圖1 關于畢赤酵母的研究論文數(shù)隨時間的變化Fig.1 The change of the number of references on Pichia pastoris(P.pastoris)with time

圖2 畢赤酵母文獻類型的組成Fig.2 The composition of reference types of P.pastoris

圖3 畢赤酵母文獻來源的前十個國家Fig.3 The countries which are the top 10 references sources of P.pastoris

畢赤酵母研究的文獻共來自71個國家和地區(qū)。發(fā)表文獻總數(shù)前10的國家見圖3。其文獻總數(shù)為1 899篇，占58.07%。排名前10的國家依次是中國、美國、德國、日本、西班牙、奧地利、韓國、法國、英國、印度，其中中國發(fā)表文獻634篇，占總文獻量的19.39%。圖4是來自前10名國家的每篇文獻平均引用數(shù)。美國的每篇文獻平均引用數(shù)最多，為21.88。后面是法國(20.13)、英國(18.35)、德國(18.05)。中國的每篇文獻平均引用數(shù)最少，為7.12。這說明來自中國的有關畢赤酵母的文獻量最多，受到的關注度卻并不高。

圖4 文獻總數(shù)前十的國家的每篇文獻的引用數(shù)Fig.4 The number of references from different countries which have the top 10 total number of references

2.4 總文獻數(shù)前五的國家在近十年內的文獻數(shù)量

對發(fā)表文獻總數(shù)前5名國家的文獻時間進行分析，可以看出中國的文獻增長趨勢較為明顯(圖5)。中國文獻數(shù)從2004一直增長到2009年，經2010年文獻數(shù)有所降低后持續(xù)增長。2012年來自中國的文獻為93篇，是美國發(fā)表文獻最多年份文獻數(shù)量(2011年35篇)的2.66倍。來自美國的文獻數(shù)目出現(xiàn)高低的波動，總體上呈2個鐘形曲線。其文獻數(shù)在2004年至2006年期間增加，之后下降到2009年的22篇，2010年和2012年出現(xiàn)短暫增加后又出現(xiàn)下降的趨勢。來自德國、日本、西班牙的文獻在各個年份基本持平，這說明這些國家有關畢赤酵母的研究處于較穩(wěn)定狀態(tài)。自2006年后，每年來自中國的文獻數(shù)量遠高于其他國家的文獻量，說明我國是研究畢赤酵母的活躍地區(qū)。

圖5 發(fā)表文獻數(shù)前5的國家發(fā)表文獻數(shù)隨時間的變化Fig.5 The change of references number with time in countries which have the top 5 references numbers

2.5 基于維普的國內文獻數(shù)量變化

近十年來，國內研究畢赤酵母的文獻數(shù)自2004年以來逐漸增加，直到2006年文獻數(shù)量達到150篇后有較大波動，但總體文獻數(shù)處于持平狀態(tài)(圖6)。每年在國內發(fā)表的文獻數(shù)量高于在國際刊物上發(fā)表的文獻數(shù)量，說明我國研究人員更偏向于發(fā)表國內期刊。

圖6 國內發(fā)表文獻數(shù)隨時間的變化Fig.6 The change of domestic references number with time

3 研究展望

3.1 基因表達技術

為了簡化畢赤酵母重組蛋白的純化步驟，畢赤酵母實現(xiàn)了分泌表達多種外源蛋白。但是分泌蛋白表達量相比于胞內蛋白表達量較低。這是由于外源基因的密碼子在畢赤酵母中的轉錄、翻譯效率低。增加密碼子偏好性可以得到適合畢赤酵母的基因序列，這是一個有效提高外源蛋白表達量的方法［10］。提高目的基因的拷貝量也是一種選擇。雖然外源蛋白的表達量與其基因拷貝量不是線性正相關［11］，但是提高拷貝數(shù)可明顯提高外源蛋白的表達量。另外，提高外源基因在畢赤酵母中表達量的方法還有開發(fā)效率高的質粒［12］，提高重組畢赤酵母的二羥丙酮合成酶、己糖轉移酶、甲醛脫氫酶活力，提高畢赤酵母比生長速率、比底物利用速率、比產物生產速率［13］等。其他種類蛋白作為分子伴侶也對提高外源蛋白的表達量有著促進作用［14］。畢赤酵母有成熟的基因敲除技術開發(fā)不同表型的宿主［15］和代謝控制研究［16］。

畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前最成功的接近人源蛋白糖基化的表達系統(tǒng)［17］(圖7)。所以科學家們力圖從發(fā)現(xiàn)糖基化轉移酶，糖基化酶基因敲除，導入糖水解酶，蛋白質基因序列突變等方式使畢赤酵母能夠表達具有人源糖基化的蛋白質。圖7中畢赤酵母表達蛋白質的糖基化結構中甘露糖的數(shù)目為8～14，其中黑色框內是具有8個甘露糖和2個 N-乙酰葡萄糖胺(Man8NacGlu2)的基本結構。由于人源蛋白質糖基化過程是先在內質網(wǎng)中形成Man8NacGlu2，然后糖結構轉移到高爾基體，在 α-甘露糖酶的催化下形成Man5NacGlu2，進而在N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I的催化下形成GlcNAcMan5GlcNAc，最后經甘露糖苷酶Ⅱ和N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Ⅱ形成GlcNAc2Man3Glc-NAc2［18］。Hamilton等構建唾液酸相關基因和II型膜蛋白定位序列，得到 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。這個糖鏈結構雖然與人源蛋白的糖基化還有差異，但是與哺乳動物細胞表達的蛋白質具有一樣的糖基化結構［19］。目前已有研究成功將畢赤酵母糖基化途徑改造后表達適于人的重組蛋白［20］。畢赤酵母來源的蛋白質O-糖基化組成主要是甘露糖，而人源蛋白的O-糖基化的糖組分可能是N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、唾液酸等多種組分。目前關于O-糖基化的研究遠沒有N-糖基化充分。但是最近Nett闡明了畢赤酵母O-糖基化酶基因，為減少畢赤酵母O-糖基化的甘露糖變?yōu)?N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、唾液酸提供了基礎［21］。

圖7 人源蛋白的N糖基化和畢赤酵母來源蛋白N糖基化結構示意圖Fig.7 The sugar chain structures of gly-protein from human and P.pastoris

畢赤酵母表達外源蛋白的嚴格調控機制是由于AOX的上游序列。AOX1在畢赤酵母中的量占總AOX的95%，闡明PAOX1啟動子的控制序列得到不受葡萄糖、乙醇抑制的AOX1上游序列將克服畢赤酵母甲醇代謝的能量限制，大幅度提高外源蛋白表達量，AOX1上游調控序列的研究是一個熱點。Inan博士將AOX1上游序列分為5個片段(A到E)。其中片段B和E對AOX1的表達有促進作用，片段C、D具有抑制作用［22］。畢赤酵母中有與片段C、D結合的抑制因子。但是 Hartner報道片段D也有促進作用［23］，這仍需進一步證實。Lin-Cereghino報道了一種結合在AOX1上游-415～-172bp之間(屬于片段D)，對AOX1有促進作用的蛋白因子(Methanol Expression Regulator 1，Mxr1)［24］。后來 Kranthi利用凝膠遷移實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和足跡法(DNaseI footprinting)證明Mxr1有6個結合位點［25］。基于以上初步研究，Vog等提出了AOX的核心調控序列［26］。但是Staley利用計算機輔助分析發(fā)現(xiàn)AOX1的控制序列具有更加復雜的調控機制，且天然的 AOX1上游序列已經是較優(yōu)的排列［27］。除了 AOX1，AOX2［28］、GAP(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Promotor)［29］、二羥丙酮(Dihydroxyacetone Synthase，DHAS)［30］的上游序列也吸引了學者的關注。

3.2 發(fā)酵策略

畢赤酵母高密度發(fā)酵表達外源蛋白條件的控制已被眾多學者總結過［31］。甲醇利用慢型的畢赤酵母在表達外源蛋白方面優(yōu)于甲醇利用快型的畢赤酵母。已有學者詳細研究了畢赤酵母表達外源蛋白的基因、分泌、葡萄糖代謝的網(wǎng)絡［32］，發(fā)現(xiàn)甲醇利用慢型畢赤酵母的瓶頸是不能提供充足的能量供細胞表達大量外源蛋白［33］，甚至造成細胞的死亡率較高［34］。調節(jié)能量來降低細胞死亡率已成為目前研究畢赤酵母高密度發(fā)酵的熱點［35］。所以能量代謝是影響畢赤酵母表達外源蛋白的一個重要因素。添加葡萄糖、甘油，犧牲AOX表達活力，補充細胞能量代謝、碳代謝是迫不得已的選擇［36］。山梨醇被發(fā)現(xiàn)是一種不抑制AOX表達活力的碳源［37］。雖然畢赤酵母利用山梨醇的速率達不到利用甘油的水平。但是添加山梨醇提高了磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)的代謝流量［38］，為畢赤酵母提供了更多的能量，提高了多種外源蛋白的表達量［39］。山梨醇和甲醇混合流加可以降低細胞的死亡率［40］。在連續(xù)高密度培養(yǎng)過程中，篩選高活性的重組菌株也是一種重要方法［41］。

3.3 過氧化物酶體吞噬

過氧化物酶體吞噬是細胞在某種生理條件下將自身的過氧化物酶體有選擇性的吞噬、降解的過程［42］。由于改變碳源就能發(fā)生2種不同類型的過氧化物酶體吞噬(微吞噬和宏吞噬)［43］，營養(yǎng)單倍體在營養(yǎng)限制時容易發(fā)生接合，容易獲得過氧化物酶體吞噬突變體，所以很適合作為研究過氧化物酶體吞噬的模式生物［44］。近年來，畢赤酵母過氧化物酶體吞噬的基因和蛋白質的研究取得了快速的發(fā)展。已有研究表明有30多個吞噬相關基因(autophagy releated gene，atg)和蛋白質(Atg)共同調控 2 種吞噬［45］。Tuttle和Sakai研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母中微吞噬和宏吞噬中有共用的基因［43］。例如，在2種過氧化物酶體的吞噬和液泡接觸的初始階段中，Atg30、Atg11、Atg7都參與微吞噬中液泡伸出臂與過氧化物酶體結合。Atg11、Atg7與Atg30結合也帶動宏吞噬中其他蛋白質一同參與吞噬體的形成［46］。微吞噬的液泡膜伸出臂延長和宏吞噬吞噬體形成階段，Atg8(類泛素蛋白)、Atg9和Atg26參與微吞噬的MIPA和宏吞噬吞噬體形成［47］。Atg24參與2種吞噬中過氧化物酶體在液泡中的降解過程［48］。畢赤酵母過氧化物酶體吞噬中還有多種吞噬相關蛋白起作用，吞噬機理尚未闡述清楚，例如MIPA組分的來源，啟動吞噬的機理有待進一步研究證實。

4 結語

有關畢赤酵母的研究逐年增多，說明越來越多的研究人員認識到畢赤酵母在外源蛋白表達、高附加值產物的生產方面的優(yōu)勢。其中我國關于畢赤酵母的文獻數(shù)量多說明我國這方面的投入大，但是每篇文獻的引用數(shù)較低也反映出研究水平不高的問題。美國等其他國家文獻數(shù)量變化不大，但是新研究方向都是他們引領。比較我國人員在國內外發(fā)表的文獻數(shù)說明我國研究人員應將更多的研究成果展示到外國，從而引起國際上科學家或者學者的關注，增加影響力。近年來關于畢赤酵母新的研究方向已經出現(xiàn)，我們不僅應該把握新的研究進展，還應當開拓新的研究方向。

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