1株具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的牡蠣共生真菌的鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化*

王鳳舞，孟麗媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266109)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的老年性腦神經(jīng)退行性病變，發(fā)病率較高，已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重威脅老年人生命的疾病之一［1］。關(guān)于AD病理較為接受的為“膽堿能缺失學(xué)說”，認(rèn)為大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致 AD的關(guān)鍵原因［2-3］，目前AD的治療臨床上主要是采用乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、加蘭他敏、石杉堿甲等，這些藥物可以提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿的水平，具有一定的療效，但是化學(xué)藥物副作用比較明顯，不利于患者長期服用。

目前如何從天然產(chǎn)物中尋找并開發(fā)抗AD藥物成為研究人員關(guān)注的新焦點(diǎn)［4］。其中特境微生物——共(內(nèi))生菌作為新的藥物來源已經(jīng)顯示出巨大的開發(fā)潛力。共(內(nèi))生菌是指寄生于宿主體內(nèi)并且不引起宿主致病癥狀的一類微生物，在與宿主長期共進(jìn)化的過程中進(jìn)行了“基因重組”，因而能產(chǎn)生豐富的活性次生代謝產(chǎn)物［5］。

牡蠣，又名蠔，營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、維生素、?；撬岬葼I養(yǎng)成分及多種功能活性成分，具有很好的強(qiáng)肝解毒、抗癌、滋容養(yǎng)顏，延緩衰老的功效，長期食用可以預(yù)防老年癡呆［6］?；趦?nèi)共生理論，牡蠣共生菌產(chǎn)生抗老年癡呆活性成分的可能性極大。在前期的試驗(yàn)中，本課題組已從牡蠣中分離篩選獲得1株共生真菌WFW mL4，其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性。本論文擬對該菌株進(jìn)行菌種的鑒定，并對其進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，促進(jìn)有益成分大量產(chǎn)生，為天然抗老年癡呆先導(dǎo)化合物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株:牡蠣(青島海域)中分離得到的共生真菌WFW mL4。

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖2%，馬鈴薯20%，瓊脂2.0%，海水加熱溶解。

種子液培養(yǎng)基:2.0%蔗糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

察氏培養(yǎng)基:3.0% 蔗糖，0.3%NaNO3，0.05%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.001%FeSO4，0.01%K2HPO4，0.1% 酵母膏，海水加熱溶解。

PD培養(yǎng)基:2.0%葡萄糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

PS培養(yǎng)基:2.0%蔗糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

SP 培養(yǎng)基:蔗糖2.0 g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.15 g，VB11 mg，馬鈴薯浸汁100 mL 加熱溶解，分裝滅菌。

SP’培養(yǎng)基:蔗糖 2.0 g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.15 g，VB11 mg，pH 6.0，馬鈴薯蒸餾水浸汁 100 mL加熱溶解，分裝滅菌。

試劑:十二烷基磺酸鈉SDS，乙酰膽堿酯酶，乙酰膽堿碘代物AchI，3，5-二硫二硝基苯甲酸DTNB，他克林，sigma;乙酸乙酯，天津富宇精細(xì)化工;SK8229真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒;Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-SⅡ，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;恒溫振蕩器IS-RDH1，蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司;DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱，中國龍口市先科儀器有限公司;IS-RDV3立式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;冷凍干燥機(jī)FD-1D-80，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DU-800紫外/可見分光光度計(jì)，美國貝克曼公司;PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，加拿大BBI公司;3730測序列分析儀，美國 ABI公司;TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;電子分析天平，美國奧豪斯電子天平公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 WFW mL4 菌株鑒定

1.3.1.1 WFW mL4 菌株形態(tài)鑒定

將保藏的菌種于PDA平板中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征及子囊孢子特征。菌落特征主要包括菌落的形狀、大小、顏色、表面狀況、質(zhì)地、光澤等。在顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)及子囊果和子囊孢子的形態(tài)等［7-9］。

1.3.1.2 WFW mL4 菌株分子生物學(xué)鑒定

菌株分子生物學(xué)鑒定通過測定該真菌的18S rDNA序列進(jìn)行種屬鑒定［10］。

(1)基因組提取及電泳檢測

①基因組提取:按照生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。

②PCR反應(yīng):

引物序列:

NS15’ GTAGTCATATGCTTGTCTC 3’

NS65’ GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 3’

PCR擴(kuò)增程序:

模版，1 μL;引物 NS1，NS6，各 1 μL;Taq 酶，1 μL;Buffer，5 μL;dNTP，4 μL;無菌水，37 μL;共計(jì)50 μL。

③PCR產(chǎn)物電泳:1.2%瓊脂糖電泳檢測。

(2)DNA瓊脂糖切膠回收純化:采用Omega回收試劑盒。

(3)目的片段TA連接

在微量離心管中加入 1 μL PEASY-T1溶液，4 μL DNA溶液。30℃反應(yīng)5 min。取出Top10感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。將反應(yīng)液加入到感受態(tài)細(xì)胞中。冰浴30 min。42℃熱激30 s，冰浴3 min以上。加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基300 μL，在37℃搖床200 r/min，40 min。取出離心管，8 000 r/min離心數(shù)秒，吸取200 μL，上清液棄掉。余下的重懸涂 LB平板(Amp)。選用藍(lán)白斑篩選，37℃恒溫過夜培養(yǎng)。次日挑取白色單菌落在加Amp的液體LB培養(yǎng)基搖床7h，送測序公司測序。

(4)DNA測序

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

(5)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析

將測定的該菌株的18S rDNA基因序列通過BLAST軟件將該序列與基因庫中相關(guān)序列進(jìn)行比對并進(jìn)行同源性比較，進(jìn)而確定菌株的分類。利用MEGA4.0軟件中的鄰接法(neighbour-joining method，NJ)［11］，將相關(guān)性最高的菌株同 WFW mL4 菌株一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.2 菌株WFW mL4液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.2.1 不同培養(yǎng)基對菌株WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

分別選取察氏培養(yǎng)基、PD培養(yǎng)基、PS培養(yǎng)基、SP培養(yǎng)基、SP’培養(yǎng)基作為該菌發(fā)酵培養(yǎng)基，固定接種量10%，500 mL三角瓶裝液量150 mL，在28℃發(fā)酵10 d。所得發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，配制成5 mg/mL濃度，測定其AChE抑制率。選取最適合該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.2 裝液量對菌株 WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，500 mL三角瓶裝液量分別為 50、100、150、200 和250 mL，測定 5 mg/mL 發(fā)酵液提取物抑制AChE活性，選擇最適發(fā)酵裝液量。每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.3 發(fā)酵溫度對菌株WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

以SP培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度分別選取19、22、25、28 和31 ℃，固定其他條件不變，測定代謝產(chǎn)物的AChE抑制率。選取最適合該菌的發(fā)酵溫度，每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.4 發(fā)酵時(shí)間對菌株WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，發(fā)酵時(shí)間分別為6、8、10、12和14 d。制備發(fā)酵液乙酸乙酯相浸膏，配制成5 mg/mL濃度，測定其 AChE抑制率。選取適合該菌產(chǎn)生AChE抑制物的最佳發(fā)酵條件。每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.5 培養(yǎng)基初始pH值對菌株WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)到 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，測定 5 mg/mL 發(fā)酵液提取物抑制AChE活性，選取最適合該菌產(chǎn)生AChE抑制物的發(fā)酵培養(yǎng)基pH。每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.6 接種量對菌株 WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，接種量分別為1%、5%、10%、15%和20%，測定5 mg/mL發(fā)酵液提取物抑制AChE活性，選取最適接種量。每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.7 光照時(shí)間對菌株WFW mL4次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，接種后先避光，后見光培養(yǎng)，見光培養(yǎng)時(shí)間分別選取 0、2、4、6、8 d，總發(fā)酵時(shí)間為10 d。測定5 mg/mL發(fā)酵液提取物抑制AChE活性，選取最適的光照時(shí)間。每種處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定

抑制AChE活性測定參照改良Ellman法［12］。取4支10 mL的試管(1～4)分別標(biāo)注為空白、對照、樣品、本底放于37℃的恒溫水浴中，向這4支試管中分別添加 pH=8.0 磷酸緩沖液(2 950 μL、2 880 μL、2 880 μL、2 950 μL)、乙酰膽堿碘代物20 μL、顯色劑DTNB 100 μL;然后向1、2號試管中各加入 DMSO 100 μL，3、4 號試管中各加入待測樣品溶液 100 μL，2、3號試管中再各加入70 μL的乙酰膽堿酯酶后混勻、在水浴中反應(yīng)4 min 20 s后再向各試管中分別添加40%的SDS終止劑100 μL終止反應(yīng);最后在412 nm下測其OD值，通過計(jì)算公式計(jì)算出樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制率［13］:

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株WFW mL4鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株WFW mL4形態(tài)學(xué)特征

菌株WFW mL4的形態(tài)學(xué)特征如圖1所示。該菌為絲狀真菌，在PDA培養(yǎng)基平板上快速生長，形成白色疏松絨毛狀菌落。菌絲為白色，有分枝和橫隔。當(dāng)該菌接種到PDA培養(yǎng)基上7 d后，在菌落中心逐漸出現(xiàn)黃色顆粒，該黃色顆粒為未成熟的子囊果;10 d后，子囊果成熟變成黑色。子囊果的外周被橄欖色或者黃綠色的附屬絲包圍著。子囊孢子是淺棕色，檸檬狀。菌株WFW mL4的形態(tài)學(xué)特征和文獻(xiàn)中報(bào)道的球毛殼菌的形態(tài)學(xué)特征相符合［8］。

圖1 菌株WFW mL4的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological features of strain WFW mL4

2.1.2 WFW mL4菌株分子生物學(xué)鑒定

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of PCR product

圖2為菌株WFW mL4的18S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖，可以看出，菌株WFW mL4的18S rDNA片段長度在1 000～2 000 bp之間。菌株WFW mL4的18S rDNA序列長度為1 691bp，與電泳結(jié)果一致。該核酸序列已被加載到 GenBank中，登陸號為JQ964323。利用BLAST軟件將該序列與美國生物信息中心(NCBI)進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明:菌株WFW mL4的18S rDNA與球毛殼菌的相似度高達(dá)99%，參考菌株的 GenBank登錄號 DQ234257，AY545725，JQ686920，JN639019 和 AB048285，同 時(shí)，利 用MEGA4.0軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

通過菌株WFW mL4的形態(tài)學(xué)特征和18S rDNA序列，可以確定該菌株為球毛殼菌(Chaetomium globosum)。該菌種已被保存到中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號為CGMCC NO.6571。

2.2 菌株C.globosum WFW mL4液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同培養(yǎng)基對菌株 C.globosum WFW mL4發(fā)酵液提取物AChE抑制率的影響

圖3 菌株WFW mL4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain WFW mL4

本實(shí)驗(yàn)研究了5種發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株C.globosum WFW mL4次生代謝物AChE抑制率的影響。如圖4所示，柱狀圖上不同字母表示差異顯著，由此可以看出:5種培養(yǎng)基對于該菌發(fā)酵液粗浸膏的AChE抑制率影響顯著(P＜0.05)。采用SP培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的粗浸膏對 AChE抑制率最大，為(47.19±0.76%)%。SP培養(yǎng)基是最適合該菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基。SP與SP’培養(yǎng)基的區(qū)別是前者采用海水配制，后者采用蒸餾水配制。從圖中可以看出，用SP培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的粗浸膏的AChE抑制率明顯高于SP’，這說明了海水環(huán)境對于C.globosum WFW mL4發(fā)酵產(chǎn)生抑制AChE活性的次生代謝產(chǎn)物是必需的。這可能是由于海水造成的高鹽、高壓環(huán)境對海洋真菌C.globosum WFW mL4次生代謝途徑的影響，從而影響其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生［14］。

2.2.2 裝液量對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

裝液量是間接評價(jià)溶氧量對發(fā)酵代謝影響的指標(biāo)。由圖5可以看出，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液提取物對AChE的抑制率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)500 mL三角瓶裝液量為200 mL時(shí)，發(fā)酵液提取物對AChE的抑制率達(dá)到最大值，為(68.07±3.23)%，這說明C.globosum WFW mL4菌株在液體發(fā)酵的過程中是需要氧氣的。因此，確定C.globosum WFW mL4菌株液體發(fā)酵500 mL三角瓶的最佳裝液量為200 mL。

2.2.3 發(fā)酵溫度對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

圖4 不同培養(yǎng)基對粗浸膏的AChE抑制率的影響Fig.4 Effect of medium on the AChE inhibition rate of crude residue

圖5 裝液量對發(fā)酵液提取物AChE抑制率的影響Fig.5 Effect of culture volume on inhibition ratio of AChE

圖6 發(fā)酵溫度對粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的影響Fig.6 Impact of fermentation temperature on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

由圖6可以看出，溫度對發(fā)酵液粗浸膏AChE抑制率的影響較小，說明菌株C.globosum WFW mL4的適應(yīng)溫度范圍較寬。菌株的適應(yīng)發(fā)酵溫度可能與其宿主有關(guān)，有研究表明牡蠣生長的最佳水溫為22℃，其攝食和代謝的水溫在18～28℃處于較適宜水平［15］。當(dāng)發(fā)酵溫度低于22℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，該菌株發(fā)酵液粗浸膏的質(zhì)量以及其對AChE的抑制率均隨之增大，當(dāng)達(dá)到22～28℃時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量變化趨勢不明顯，在25℃時(shí)達(dá)到最大值，其粗浸膏質(zhì)量為(166.25 ± 8.71)mg，AChE 抑制率為(65.69 ±1.69)%。當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量及其AChE抑制率均下降，說明溫度過高會(huì)抑制菌株AChE活性代謝產(chǎn)物的合成和分泌。因此，確定該菌株液體發(fā)酵的最佳溫度為25℃。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

圖7 發(fā)酵時(shí)間對粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

在真菌液體發(fā)酵過程中，其次級活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生時(shí)間有所不同。由圖7可以看出，在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量及其對AChE活性抑制率逐漸升高，到第10天時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量達(dá)到最大值(154.7 ± 19.8)mg，此時(shí)其AChE抑制率為(67.43±1.30)%。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量開始下降，其對AChE抑制率增長不明顯。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期菌絲體初級代謝為主，次生代謝為輔，進(jìn)行大量生長增殖，產(chǎn)生的少量次生代謝產(chǎn)物并未及時(shí)排出細(xì)胞外;到發(fā)酵中后期以次級代謝為主，開始產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物并排出細(xì)胞外;到發(fā)酵后期，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)已被消耗盡，部分菌絲體自溶，培養(yǎng)基粘度增大影響氧氣傳遞速率，影響次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生或者影響次生代謝途徑［16］。因此，確定 C.globosum WFW mL4菌株最佳液體發(fā)酵時(shí)間為10 d。

2.2.5 培養(yǎng)基初始 pH對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對菌株的生長和代謝有直接影響，初始pH值應(yīng)使菌株快速生長并且有利于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生［16］。在圖8中，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的變化趨勢較明顯，表明發(fā)酵液的初始pH對C.globosum WFW mL4菌株產(chǎn)抑制AChE活性代謝物的影響顯著。該菌在pH=6.0時(shí)發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量以及其對AChE抑制率達(dá)到最大值，即粗浸膏質(zhì)量為(165.55 ± 8.15)mg，AChE 抑制率為(65.61±0.98)%。原因可能是該菌的生長環(huán)境pH對該菌的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生具有激發(fā)作用。因此該菌的最適發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.0。

圖8 pH值對粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的影響Fig.8 Effect of incubation pH value on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

2.2.6 接種量對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

接種量的多少可影響液體發(fā)酵過程中菌絲體的生長速度及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖9可以看出，接種量從1%到10%，隨著接種量的增加，該菌株發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量及其AChE抑制率均隨之增強(qiáng)，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量及其AChE抑制率達(dá)到最大值，分別為(158.15 ±8.71)mg，(68.45 ±1.03)%。接種量繼續(xù)增大時(shí)，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量及其對AChE的抑制率均出現(xiàn)下降趨勢。原因可能為接種量過大，引入的抑制次生代謝的有害物質(zhì)相應(yīng)增多，對產(chǎn)物的合成不利，或者菌絲體在發(fā)酵前期生長過于旺盛，空間和資源相對匱乏，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被大量消耗，進(jìn)而影響發(fā)酵后期代謝產(chǎn)物的形成和分泌［16］。因此，確定 C.globosum WFW mL4菌株液體發(fā)酵的最佳接種量為10%。

圖9 接種量對粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的影響Fig.9 Effect of inoculum concentration on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

2.2.7 光照時(shí)間對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產(chǎn)物的影響

圖10 光照時(shí)間對粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率的影響Fig.1 0 Effect of light period on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

由圖10可知，隨著光照時(shí)間的變化，發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率并未呈現(xiàn)規(guī)律性趨勢，說明光照時(shí)間對C.globosum WFW mL4菌株發(fā)酵液粗浸膏質(zhì)量和AChE抑制率幾乎無影響或者影響不大。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，可確定WFW mL4菌為球毛殼菌，命名為 Chaetomium globosum WFW mL4。

(2)從發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:該菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基為SP培養(yǎng)基，并且該菌株只在海水環(huán)境下代謝產(chǎn)生AChE抑制物;培養(yǎng)基的初始pH對該菌株產(chǎn)AChE代謝產(chǎn)物的影響顯著，其最適培養(yǎng)基pH為6.0;發(fā)酵的最佳接種量為10%，500 mL三角瓶的最佳裝液量為200 mL，最適的發(fā)酵溫度和時(shí)間分別為25℃和10 d，光照時(shí)間對該菌株發(fā)酵幾乎無影響。

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