微波固相合成大豆分離蛋白-乳糖接枝物及其流變特性研究*

石燕，陳智韡，涂宗財，，王 輝，黃小琴，沙小梅，張 璆，李雪

1(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學食品科學與工程系，江西南昌，330047)

2(江西師范大學生命科學學院，江西南昌，330022)

流變學是研究物質(zhì)的流動和變形的科學，它與物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。通過對食品流變特性的研究，可以了解食品的組成、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和分子形態(tài)等，可為產(chǎn)品配方、加工工藝、設(shè)備選型及質(zhì)量檢測等提供理論依據(jù)［1-2］。

大豆分離蛋白(SPI)是一種蛋白含量90%以上的商用大豆蛋白產(chǎn)品，營養(yǎng)價值高，功能性良好，價格便宜，資源豐富，作為一種重要的原料廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中［3］。大豆蛋白的流變性在調(diào)整食品的物性方面十分重要，在飲料、湯等流體食品中，蛋白質(zhì)體系的黏彈性是重要功能性質(zhì);另一方面，研究蛋白質(zhì)流變特性，通過分析樣品粘彈性的改變，推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化［2］。

微波加熱(mircowave heating，MH)是一種安全、高效、節(jié)能的熱處理方法，它能保持產(chǎn)品中更多營養(yǎng)成分，并廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中［4］。微波加熱對糖基化修飾的研究［5-7］已有報道，這些研究大多通過緩沖溶液或液體進行傳導，微波固相加熱糖基化的研究較少［8］。微波輻射用于加熱的機理是微波輻照導致目標分子電偶極子發(fā)生旋轉(zhuǎn)和振動。水分子屬極性分子，介電常數(shù)較大，微波輻射優(yōu)先被水分子吸收，而蛋白質(zhì)、碳水化合物等的介電常數(shù)相對較小，其對微波的吸收能力比水小得多。因此，為了減少由于水分子優(yōu)先被加熱而導致目標分子間接加熱的影響，本研究采用微波加熱大豆分離蛋白-乳糖固體混合物的方法來合成蛋白質(zhì)-糖接枝物，并且對接枝物流變特性的變化進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆蛋白:粗蛋白含量65.0%，水分7.0%，谷神生物科技集團有限公司;乳糖，阿拉丁，鄰苯二甲醛(OPA)，Sigma公司;Mark(10～200kDa)，F(xiàn)ermentas公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)，β-巰基乙醇，硼砂，甲醇，硅油，30%聚丙烯酰胺，Tri-HCl(pH 6.8)緩沖溶液，Tri-HCl(pH 8.8)緩沖溶液，4×蛋白質(zhì)上樣緩沖溶液，NaOH，HCl等均為分析純。

LGJ-1型冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;電泳儀，美國伯樂BIO-RAD公司;UV-3200型分光光度計，上海美譜達儀器有限分司;Discovery DHR-2型流變儀，美國TA儀器;TGL-10C型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;G80F20CN2L-B8(RO)型微波爐，格蘭仕微波爐電器制造有限分司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI的制備

大豆蛋白與蒸餾水按質(zhì)量比1∶10混合，室溫下低速攪拌2h，攪拌過程用1 mol/L NaOH保持pH 8.5?；旌弦航?jīng)8 000×g離心30 min除去不溶物，上清液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，溶液經(jīng)5 000×g離心15 min，去除上清液，收集蛋白質(zhì)凝乳，凝乳經(jīng)蒸餾水沖洗2～3次后，加入蒸餾水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，攪拌，待沉淀充分溶解后經(jīng)8 000×g離心30 min除去不溶物，上清液冷凍干燥［9］。

1.2.2 樣品的制備

稱取等質(zhì)量的SPI與乳糖置于研缽中研磨，混合均勻后過150目篩，收集篩出物。SPI-乳糖混合物(水分含量為7.2%)在800W微波功率下加熱不同時間(30、60、90、120、150、180 s)，冰水浴結(jié)束反應(yīng)。不同樣品配成50 mL溶液，4℃透析2 d，再將溶液稀釋至100 mL，離心(3 000×g)除去不溶物，取10 mL混合物樣品置于冰箱保存，其余樣品凍干制成干粉。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用SDS-PAGE測定大豆分離蛋白和不同微波條件處理 SPI-乳糖接枝物的亞基組成和分子質(zhì)量［10］。SDS-PAGE采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制備而成，電泳前，所有樣品均煮沸6～8 min，進樣量10 μL，恒壓，濃縮膠電壓 50V/板，分離膠 110V/板，考馬斯亮藍R-250染色，7%醋酸脫色。

1.2.4 自由氨基的測定

采用OPA法對蛋白質(zhì)中自由氨基進行測定，在文獻［11-12］方法的基礎(chǔ)上進行改進:準確稱取40 mg OPA溶解于1 mL的甲醇中，依次加入0.2 g/mL SDS 2.5 mL，0.1 mol/L 的硼砂25 mL 及 100μL β-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50 mL?？瞻滓翰患覱PA。測定時，各取空白液、OPA試劑4 mL于試管中，分別注入200 μL樣品溶液，混勻后于35℃反應(yīng)2 min，340 nm下測其吸光值A(chǔ)340。以賴氨酸作出標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中自由氨基的含量。

1.2.5 流變學分析

配制濃度為0.1 g/mL的樣品溶液，利用Discovery DHR-2型流變儀測定溶液的流變特性。DHR-2型流變儀，40mm直徑，2°的平行板，間隙為1mm，目標應(yīng)變(target strain)保持0.5%(此應(yīng)變在線性黏彈區(qū)域內(nèi))。所有流變學性質(zhì)測定均重復2次。

1.2.5.1 頻率掃描分析

取2 mL樣品放置在平行板上，掃描頻率在0.1～10Hz，記錄儲能模量(storage moduli，G＇)和損耗模量(loss moduli，G")的變化［13］，并分析樣品相對黏彈性tanδ(tanδ=G"/G＇)隨頻率的變化情況。加樣前將平板的的溫度調(diào)至25℃，實驗時保持溫度不變。

1.2.5.2 動態(tài)黏彈性分析

取2 mL樣品放置在平行板上，為了防止水分蒸發(fā)，在樣品裸露部位覆蓋一層硅油。測量時，振蕩頻率1Hz。樣品在25℃平衡1 min，隨后溫度以5℃/min的速率從25℃升到95℃，并在95℃保持10 min。再以5℃/min的速率從95℃下降到25℃［14］。記錄此過程樣品的G＇隨時間的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE

圖1為SPI和800W不同時間微波加熱SPI-乳糖接枝物電泳圖。由圖1可知，微波加熱時間較短(0、30 s)時，電泳條帶變化不明顯，隨微波時間延長，SPI-乳糖接枝物的條帶向上移動，這表明蛋白分子質(zhì)量增加。蛋白質(zhì)與糖反應(yīng)時，蛋白中的自由氨基和糖的還原性末端共價結(jié)合和蛋白分子之間發(fā)生聚集［15-16］，導致SPI-乳糖共聚物分子質(zhì)量增加。當微波處理時間達到90 s后，隨處理時間增加，大豆球蛋白(11S)中的堿性亞基B變得越來越模糊，這可能是堿性亞基B最不穩(wěn)定，最易發(fā)生聚合過度加熱會使蛋白質(zhì)中小分子基團發(fā)生聚集;微波加熱后，電泳圖譜中分子質(zhì)量在30～70kDa之間出現(xiàn)了新條帶，這些亞基可能是由于蛋白-蛋白/蛋白-糖形成新的聚合物［13］。

圖1 SPI和MH不同時間SPI-乳糖接枝物電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of SPI and SPI-lactose graft under different MH time

2.2 自由氨基含量變化

糖基化過程中，蛋白中伯胺基基團呈現(xiàn)出高的活性，因此，糖化的自由氨基數(shù)量可以作為評價糖基化反應(yīng)程度的標準［8］。圖2為800W微波不同時間接枝物自由氨基含量的變化圖，由圖2可知，隨微波時間的延長，SPI中自由氨基含量明顯減少。因為在同功率下，微波時間越長，溫度越高，高溫導致大豆蛋白降解，變性，并重新發(fā)生聚集，變性的蛋白質(zhì)與糖的還原性末端發(fā)生羰氨縮合反應(yīng)，這與SDS-PAGE結(jié)論一致。同時，當處理時間超過150 s時，樣品明顯逐漸變黑，可能是高溫導致樣品發(fā)生炭化。

圖2 MH不同時間SPI-乳糖接枝物自由氨基含量的變化Fig.2 Changes in free amino group content of SPI-lactose graft under different MH time

2.3 頻率掃描分析

由圖3可見，原樣SPI和經(jīng)微波糖基化處理后的SPI溶液的G＇和G"均隨頻率的增大而升高，樣品黏彈性均有所增強;圖4可知，SPI-乳糖接枝物溶液tanδ比原樣SPI小，這表明未處理的SPI更具有黏性，而經(jīng)過微波糖基化后SPI樣品呈現(xiàn)出更大的彈性。SPI經(jīng)微波糖基化處理后，會增強SPI分子間/SPI和乳糖分子間相互作用，從而增強SPI分子間非共價鍵(氫鍵)和 SPI-糖分子間的共價結(jié)合［3］，因而 SPI-乳糖接枝物彈性增強。

圖3 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物G＇和G"隨頻率變化圖Fig.3 G＇and G"as a function of oscillation frequency of SPI and SPI-Lactose graft after after MH 120 s

2.4 動態(tài)黏彈性分析

圖4 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物相對黏彈性(tanδ)隨頻度變化圖Fig.4 tanδ as a function of oscillation frequency of SPI and SPI-Lactose graft MH 120 s

由圖5可知，熱循環(huán)處理過程中，原樣SPI溶液G＇在升溫和恒溫無明顯變化，在降溫階段顯著增加;而經(jīng)微波糖化處理后的樣品G＇隨溫度變化不明顯。圖5局部放大圖所示，在升溫階段原樣和微波糖化后的樣品G＇均略有下降;恒溫階段原樣G＇略有升高，微波糖化后G＇略有下降;降溫階段兩者G＇均增加，并且原樣增加更顯著。原因可能是，在升溫階段，隨溫度的升高，樣品中的氫鍵穩(wěn)定性降低［17］，氫鍵的斷裂將會導致G＇減少。在此階段，經(jīng)微波處理后的接枝物樣品G＇較原樣SPI大，可能是因為經(jīng)過微波糖化處理后存在多肽鏈間或/和多肽與糖分子間的相互作用，因而SPI-乳糖接枝物彈性增大;在95℃恒溫階段，原樣SPI溶液G＇隨時間的延長有所提高，而SPI-乳糖接枝物溶液G＇略有下降，且SPI溶液G＇較大。可能是由于溫度升高時，蛋白溶液疏水作用更穩(wěn)定，蛋白溶液G＇增強。而SPI經(jīng)微波糖基化作用后可能會減弱疏水作用或減少疏水基團，改性后的蛋白質(zhì)在熱變性時將會抑制較遠的區(qū)域形成疏水作用。SPI經(jīng)微波糖化減弱疏水作用與溶液溫度升高穩(wěn)定疏水作用共同影響導致改性后溶液G＇略有下降;在降溫階段，G＇均增加，原樣SPI溶液增加更顯著，在熱循環(huán)結(jié)束階段，原樣SPI溶液G＇最大。可能是因為溫度降低，氫鍵的穩(wěn)定性增強，SPI經(jīng)微波糖基化修飾后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導致熱循環(huán)過程中降低了形成氫鍵的能力［13］。

圖5 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物隨時間動態(tài)模量的變化Fig.5 Dynamic moduli as a function of time of SPI and SPI-Lactose graft after MH 120 s

3 結(jié)論

綜上分析，800W微波處理條件下，SPI與乳糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，并隨微波時間的延長，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量逐漸增加，且在30～70 kDa出現(xiàn)了新條帶，在加熱處理90 s后，11 s中的B條帶變淡甚至消失;隨著微波處理時間的延長，SPI中自由氨基含量減少;同時，樣品的流變性質(zhì)也發(fā)生了變化，SPI-乳糖接枝物相對黏彈性(tanδ)降低 ，呈現(xiàn)出更大的彈性，表明蛋白質(zhì)分子間及蛋白-糖分子間相互作用增強。熱循環(huán)處理時，糖基化SPI溶液G＇隨溫度變化不明顯，而原樣SPI溶液G＇在降溫階段明顯增大，可為具有熱加工穩(wěn)定性的新型大豆分離蛋白的研發(fā)提供新途徑。

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