珍稀植物跳舞草愈傷組織的誘導(dǎo)

周 秘 柴麗花 李非非 龍?jiān)录t 邢朝斌

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北唐山 063000)

跳舞草(Codariocalyx motorius(Hout.t)Ohashi)為豆科舞草屬的多年生小灌木［1］，其葉可以伴隨音樂(lè)翩翩起舞，時(shí)快時(shí)慢，時(shí)左時(shí)右，時(shí)上時(shí)下，周而復(fù)始，煞是壯觀［2］，故名跳舞草。另外，《本草綱目》記載，該草可全株入藥，有舒筋活絡(luò)、祛痰化瘀的作用，其鮮葉泡水洗面，可美容養(yǎng)顏。因此，跳舞草不僅是重要的景觀植物，同時(shí)也具有很高的藥用價(jià)值。目前市面上所用的跳舞草多是由種子繁殖而來(lái)，但是跳舞草形成的種子很少且其表面有一層蠟質(zhì)層，水分難以浸入，種皮層含有抑制自身發(fā)芽的物質(zhì)，致使發(fā)芽率低下［2］。加之跳舞草的實(shí)生苗對(duì)環(huán)境要求極高，如果生長(zhǎng)環(huán)境過(guò)于陰濕，通風(fēng)不良，葉片溶液產(chǎn)生炭疽病和黑斑?。?］。導(dǎo)致通過(guò)有性繁殖難以滿足市場(chǎng)對(duì)跳舞草的需求。本文利用離體培養(yǎng)技術(shù)，初步建立了跳舞草快速繁殖的體系，分析了各種條件對(duì)跳舞草離體再生的影響，研究結(jié)果對(duì)緩解跳舞草的供需矛盾具有一定的觀察意義。

1 材料與方法

1.1 材料 跳舞草種子購(gòu)自中國(guó)林木種子公司。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌材料的獲得及外植體的消毒。種子在干凈河沙中，25℃條件下萌發(fā)后獲得實(shí)生小苗。取生長(zhǎng)旺盛的跳舞草小苗的幼嫩葉片用75%的酒精消毒10～90s后，無(wú)菌水漂洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干葉片上殘留的水分。將葉片剪成0.25 cm2大小的外植體，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS，2.00mg/LBA，0.10mg/LNAA，6.00g/L瓊脂，30.0g/L 糖，pH=5.8～6.0)中培養(yǎng) 15d，統(tǒng)計(jì)染菌率=(染菌外植體/接種的外植體總數(shù))×100%，并觀察其生長(zhǎng)狀況得到最佳的消毒時(shí)間。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及分化。利用篩選出的最佳消毒條件進(jìn)行消毒后，將無(wú)菌材料接種到含濃度激素分別為NAA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L;NAA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L，VC:1.00mg/L;IBA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L;IBA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L，VC:1.00mg/L的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行30 d的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。期間，不斷觀察外植體的生長(zhǎng)狀況。30 d后將生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織接種到含不同濃度激素配比，即NAA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L;NAA:0.02mg/L，BA:2.00mg/L，VC:1.00mg/L;NAA:0.02mg/L，KT:2.00mg/L;NAA:0.02mg/L，KT:2.00mg/L，VC:1.00mg/L;IBA:0.02mg/L，KT:2.00mg/L;IBA:0.02mg/L，KT:2.00mg/L，VC:1.00mg/L的MS培養(yǎng)基中在溫度為(25±2)℃，光照條件為2500lx，12h/d的條件下進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)，并定期觀察其生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果

2.1 最佳消毒方案 見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)所用的跳舞草較幼嫩，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采取簡(jiǎn)易且對(duì)外植體的損傷作用最小的酒精作為消毒試劑。但酒精的消毒時(shí)間至關(guān)重要。從表1可以看出消毒時(shí)間越長(zhǎng)，染菌率越低;但隨著消毒時(shí)間的增加，愈傷組織的形成情況呈現(xiàn)先正價(jià)后降低的趨勢(shì)，所以外植體的最佳消毒方案是75%的酒精消毒30s。

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 見(jiàn)圖1，表2。將無(wú)菌材料放在含不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，外植體的切口處開始出現(xiàn)明顯膨大，隨后形成愈傷組織(圖1-a)。25 d后，逐漸形成翠綠色致密顆粒狀物質(zhì)且在頂端形成白色小顆粒(圖1-b)，但也有部分出現(xiàn)局部褐化的現(xiàn)象。由表2可以看出，不同激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用具有有顯著差異。其中，當(dāng)激素為NAA:0.02 mg/L，BA:2.00 mg/L時(shí)，不僅誘導(dǎo)率較高，并且愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)好。所以，愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS，0.02 mg/L NAA，2.00 mg/L BA，糖:30.0 mg/L，瓊脂:6.00 mg/L。

表1 消毒時(shí)間對(duì)跳舞草組培的影響

表2 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 葉片分化出愈傷組織

把上述長(zhǎng)勢(shì)較好的愈傷組織接種到含不同激素的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)25 d后。均未分化出小芽，大部分愈傷組織都呈翠綠色，外觀粗糙，結(jié)構(gòu)致密且在愈傷組織的頂端都出現(xiàn)白色晶狀小顆粒。之后筆者還在培養(yǎng)基中添加了不同濃度的椰汁和土豆汁后將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，但均未出現(xiàn)具有分化能力的愈傷組織即愈傷組織呈鮮綠色，較大顆粒狀且整個(gè)外植體呈啞鈴狀。

3 討論

外植體消毒方案的選擇對(duì)跳舞草組織培養(yǎng)起著至關(guān)重要的作用。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體的消毒通常采用升汞或75%的酒精。而升汞本身是一種有毒物質(zhì)且易殘留，對(duì)外植體產(chǎn)生的毒害作用甚大［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用75%的酒精。但若消毒時(shí)間過(guò)短，則導(dǎo)致外植體消毒不徹底，染菌率增加;過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使外植體失水死亡或發(fā)生褐化，不利于培養(yǎng)。最終導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)外植體的消毒時(shí)間進(jìn)行探討得出最佳消毒方案為:75%的酒精消毒30 s，這與毛艷萍［2］等的結(jié)論一致。

植物在組織培養(yǎng)過(guò)程中，失去了協(xié)調(diào)生長(zhǎng)的物質(zhì)，打破了植物自身的調(diào)節(jié)機(jī)制，需要外加生物調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)特異性誘導(dǎo)器官和組織等的發(fā)生［4］。因此，激素是影響愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的重要因素。不同物種植物在愈傷組織誘導(dǎo)和分化時(shí)所用的激素不同，但多采用不同濃度的生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素6-BA。趙靜［5］等誘導(dǎo)跳舞草嫩莖愈傷組織生長(zhǎng)的理想培養(yǎng)基是MS+0.50 mg/LBA。在本實(shí)驗(yàn)中，以跳舞草葉片為材料，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為:MS+2.00 mg/L，BA+0.02 mg/LNAA。這說(shuō)明跳舞草葉片中的內(nèi)源生長(zhǎng)素含量相比嫩莖較低［5］。而對(duì)于不同植物中愈傷組織的分化，查帥兵［6］在繁殖安徽羽葉報(bào)春時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片需在0.1mg/L2，4-D+1.5mg/LTDZ的培養(yǎng)基中才能分化;而本實(shí)驗(yàn)中所用的激素均不能使愈傷組織分化出小芽。這可能是由于不同植物的生長(zhǎng)激素的種類、濃度及其配比影響了植物組培過(guò)程中所形成的中間繁殖體的種類［7］或者所用激素未能促進(jìn)組織中內(nèi)源腺嘌呤型細(xì)胞分裂素的積累和合成來(lái)促進(jìn)組織分化［6］。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志 (第四十一卷)［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.59

［2］毛艷萍，蘇智先，鄒利娟.珍稀植物跳舞草的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.植物研究，2010，30(1):106

［3］楊俊杰，付紅梅.跳舞草日光溫室栽培管理技術(shù)［J］.農(nóng)業(yè)工程技術(shù)·溫室園藝，2009，(7):61

［4］趙 鑫，詹立平，鄒學(xué)忠.牡丹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21(2):156

［5］趙 靜，馬微娜，馬鑫鑫，等.跳舞草愈傷組織的誘導(dǎo)及無(wú)性系建立［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，(6):86

［6］查帥兵.安徽羽葉報(bào)春愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)［J］.生物學(xué)雜志，2003，23(5):43

［7］游曉會(huì)，馬玉磊，李小遠(yuǎn).報(bào)春花屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展(綜述)［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2012，41(1):73