大越豆芋蛋白ACE抑制肽的分離純化研究

陳 龍，莊 溪，許光治，高前欣，倪勤學(xué)，楊冬冬，張有做

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安311300)

大越豆芋(Apios americana Medikus)屬是一種原產(chǎn)于美洲的豆科植物［1］，后傳入日本，現(xiàn)已在日本廣泛種植［2］。2010年本課題組從日本引進(jìn)了該作物，并在浙江試種成功。大越豆芋具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其可食用部分-塊莖中蛋白質(zhì)含量相對高于其他塊莖類植物，其中谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，同時(shí)大越豆芋塊莖中還含有其它豆科植物中含量較少的蛋氨酸和半胱氨酸，大越豆芋中的亞油酸含量也相對較高，且大越豆芋的塊莖中還具有馬鈴薯、芋頭和紅薯中所沒有的異黃酮類物質(zhì)［3-7］。同時(shí)，大越豆芋具有抗腫瘤［8］，抗高血壓等多種功能。Kunihisa lwai通過用大越豆芋的粉末和水提物喂食患有高血壓的小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠的血壓，血脂和血漿中的膽固醇含量都有所下降，并證明了大越豆芋在一定程度上對高血壓和高血脂有抑制作用，是一種健康的降壓食品［9］，然而，大越豆芋抑制高血壓和高血脂的有效成分及機(jī)理還不清楚。

蛋白質(zhì)是人體必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)。但現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究顯示，蛋白質(zhì)不僅可以為人體提供營養(yǎng)，其分解產(chǎn)物多肽還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制等多種活性功能［10］。其中ACE抑制肽對于高血壓具有良好的預(yù)防和治療作用。

為了研究大越豆芋蛋白水解產(chǎn)物中ACE抑制肽的活性，本實(shí)驗(yàn)用酶水解制備了大越豆芋蛋白多肽，研究了其ACE抑制活性。在此基礎(chǔ)上，對ACE抑制肽進(jìn)行了初步純化。以期為今后大越豆芋抗高血壓機(jī)理研究及資源的高效利用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大越豆芋 浙江農(nóng)林大學(xué)食品分子機(jī)能實(shí)驗(yàn)室;馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)sigma公司;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)sigma公司;Alcalase堿性蛋白酶 北京索寶來科技有限公司;NaOH，茚三酮，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉等試劑 均為分析純。

DA201-C型大孔吸附樹脂 鄭州勤時(shí)科技有限公司;超濾儀 美國Millipore公司;DEAE-sepharose fast flow，solarbio SepHadex G-15葡聚糖凝膠，AKTA

purifier蛋白質(zhì)純化儀 美國Amersham公司;冷凍干燥機(jī) 德國eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程 大越豆芋蛋白制備→豆芋蛋白酶解液制備→超濾分離豆芋ACE抑制肽→豆芋ACE抑制肽脫鹽處理→離子交換層析分離豆芋ACE抑制肽→SepHadex G-15法分離豆芋ACE抑制肽

1.2.2 大越豆芋蛋白的制備 豆芋塊莖經(jīng)去皮、切片后進(jìn)行冷凍干燥，用高速粉碎機(jī)將凍干后的豆芋塊莖磨成粉狀。以1mol/L的NaOH溶液調(diào)整蒸餾水的pH至8.0，使用該液作為提取液，將豆芋塊莖粉放進(jìn)40℃的提取液攪拌提取蛋白質(zhì)，豆芋塊莖粉與提取液比例為1∶20，提取時(shí)間為2h，將提取液4000r/min離心、沉淀，重復(fù)提取一次，將上清液加1mol/L HCl溶液至沉淀不再增加，4000r/min離心棄去上清液，合并沉淀，冷凍干燥，獲得大越豆芋蛋白粉末，4℃下保存?zhèn)溆茫?1］。

1.2.3 大越豆芋酶解液制備 酶解工藝以水解度和ACE抑制率為指標(biāo)進(jìn)行了優(yōu)化，稱取一定量的豆芋蛋白粉，以1.2%的底物濃度溶于pH9.5的0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中。按照3000U/g的加酶量加入Alcalase堿性蛋白酶，充分混合均勻，放置于溫度為62℃的水浴鍋中開始反應(yīng)。酶解過程中采用茚三酮法測定水解度［12-13］。酶解3h后，將酶解液加熱到90℃保持10min，以終止酶解反應(yīng)，冷卻，8000r/min離心20min，收集上清液冷凍干燥后備用，并測定ACE抑制率。

1.2.4 ACE抑制活性測定方法 ACE抑制率測定采用 Cushman［14］和 Chenung［15］的方法，并根據(jù)實(shí)際情況做相應(yīng)改進(jìn)。取0.1U ACE溶于含有0.3mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液(pH8.3)中配制成ACE粗酶液，取50μL待測樣液(溶于上述緩沖液，2mg/mL)，50μL上述緩沖溶液和100μL的反應(yīng)底液HHL(溶于相同緩沖液5mmol/L)，37℃下保溫10min。然后向其中加入20μL ACE溶液(100mU/mL)，混合均勻后在37℃下反應(yīng) 1h。向反應(yīng)好的溶液中加入 100μL 1mol/L的HCl溶液以終止反應(yīng)。然后向試管中加入1mL乙酸乙酯溶液用以抽提反應(yīng)過程中釋放出的馬尿酸。劇烈震蕩后，洗出乙酸乙酯層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至蒸干，加入3mL蒸餾水重新溶解溶質(zhì)，在228nm下測定吸光度。用50μL的緩沖液代替樣品作為空白對照。按照式(1)計(jì)算ACE抑制活性:

式中:A為空白對照的樣品吸光度值;B為加入樣品和ACE的溶液的樣品吸光度;C為未加入ACE溶液的樣品吸光度。

1.2.5 超濾分離大越豆芋ACE抑制肽 將超濾膜裝入Mini-pellicon超濾系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)超濾系統(tǒng)管路至清洗的狀態(tài)，用蒸餾水對超濾膜進(jìn)行清洗，清洗時(shí)間約為1h，然后用0.1mol/L pH為8.0的磷酸鹽緩沖液循環(huán)清洗超濾膜以達(dá)到活化的目的，將大越豆芋酶解產(chǎn)物用pH為8.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成一定濃度的溶液，用0.45μm的膜對溶液進(jìn)行一次抽濾防止沉淀物堵塞超濾膜，將處理好的溶液倒入超濾裝置的貯液罐中，設(shè)定好超濾系統(tǒng)的進(jìn)口壓力后開啟超濾儀，進(jìn)行超濾［16］。

分別采用10、5、3ku三種不同規(guī)格的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，獲得組分I(M＞10ku)、組分II(10ku＞M＞5ku)、組分 III(5ku＞M ＞3ku)、及組分 IV(M＜3ku)超濾物，收集各個(gè)組分冷凍干燥，分別測定各組分的ACE抑制率，選擇合適的超濾膜。

1.2.6 豆芋ACE抑制肽DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽處理 將預(yù)處理后的DA201-C大孔吸附樹脂裝入2.6cm×30cm的層析柱內(nèi)，加至離柱口3cm。將經(jīng)過超濾后凍干的豆芋多肽粉末配制成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，以1mL/min的流速上樣，上樣量為30mL，然后用去離子水以同樣的流速進(jìn)行洗脫，每3mL收集一管洗脫液，測定其電導(dǎo)率。當(dāng)電導(dǎo)率穩(wěn)定時(shí)用不同濃度梯度的乙醇溶液以1mL/min的流速對豆芋多肽進(jìn)行梯度洗脫，以分別收集合并每一個(gè)濃度梯度下的洗脫液，冷凍干燥后備用［17-20］。測定各個(gè)乙醇濃度梯度多肽的回收率及脫鹽率及ACE抑制率?；曳趾康臏y定采用馬弗爐灰化法(GB 5009.4-2010)。

式中:ρ為脫鹽率(%);A為原液中灰分的含量(%);B為洗脫液中灰分含量(%)。

1.2.7 離子交換層析分離豆芋ACE抑制肽 實(shí)驗(yàn)選用DEAE-SepHarose Fast Flow陰離子交換樹脂對經(jīng)過超濾和脫鹽的大越豆芋ACE抑制肽進(jìn)行分離純化。將脫鹽后的豆芋ACE抑制肽凍干粉末溶解于pH為7.8的0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液當(dāng)中，配制成20mg/mL的溶液。將填充好的層析柱用0.05mol/L的Tris-HCl(pH7.8)溶液以0.5mL/min的流速平衡1h，然后用配制好的樣品溶液上樣，上樣量為1mL，用0.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每管3mL，合并洗脫峰，將各個(gè)洗脫峰凍干后，測定各個(gè)洗脫峰的ACE抑制活性。

表1 不同分子量范圍樣品的ACE抑制活性Table 1 The ACE inhibition activities of different molecular weight sample

離子交換色譜洗脫條件:柱尺寸:1.6cm×60cm;洗脫液:NaCl量為0.5mol/L的Tris-HCl緩沖液;流速:0.75mL/min;檢測波長:220nm;上樣量:1mL(樣品濃度20mg/mL)。

1.2.8 SepHadex G-15法分離豆芋ACE抑制肽 將預(yù)處理好的SepHadexG-15凝膠填充入1.6cm×100cm的層析柱中。將填充好的層析柱裝入AKTA purifier蛋白質(zhì)純化儀中，用超純水以1mL/min的流速使層析柱平衡1h，然后上樣開始凝膠色譜分離，分管收集洗脫組分，每管5mL，樣品重復(fù)分離若干次，合并各個(gè)分離峰，將每個(gè)峰進(jìn)行凍干，測定ACE抑制的活性。凝膠分離條件:凝膠類型:SepHadex G-15;柱尺寸:1.6×100 cm;洗脫液:去離子水;流速:0.5mL/min;檢測波長:220nm;上樣量:1mL(樣品濃度100mg/mL)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是經(jīng)過三次平行實(shí)驗(yàn)得到的平均值，并采用SPSS19.0分析計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，Microsoft Excel(office 2003)軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同規(guī)格超濾膜進(jìn)行超濾對產(chǎn)物ACE抑制活性的影響

實(shí)驗(yàn)選用了三種不同規(guī)格的超濾膜進(jìn)行超濾實(shí)驗(yàn)，將收集到的濾液凍干后測定當(dāng)溶液濃度為2mg/mL時(shí)各個(gè)樣品低聚肽的ACE抑制活性，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1。通過比較不同組分的ACE抑制率可知，組分 IV(M＜3ku)的 ACE抑制率為62.32%，比原液的抑制率高出9.86%。ACE抑制率隨著豆芋多肽的分子量降低而升高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選用3ku的超濾膜對豆芋ACE抑制肽進(jìn)行超濾。

2.2 豆芋ACE抑制肽脫鹽處理

蛋白質(zhì)水解過程中常常要使用酸或堿來調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH，從而來保持蛋白酶的活性，但也因此會引入大量的鹽離子。采用DA201-C大孔吸附樹脂可以對多肽進(jìn)行脫鹽處理。使用不同濃度的乙醇梯度洗脫還能對多肽進(jìn)行分級，獲得親水性不同的多肽。實(shí)驗(yàn)分別用30%，50%，70%，90%的乙醇溶液對已經(jīng)上樣的大孔吸附樹脂進(jìn)行梯度洗脫，收集合并不同濃度梯度下的洗脫液，冷凍干燥，并測定多肽回收率，脫鹽率和ACE抑制率，結(jié)果如表2所示。豆芋ACE抑制肽得率隨乙醇濃度的增加逐漸降低，乙醇梯度洗脫后肽的總回收率為80.49%;脫鹽率隨乙醇濃度的升高而增大，當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí)脫鹽率為90.13%，當(dāng)乙醇濃度增至90%時(shí)脫鹽率增大至94.78%，由此利用大孔樹脂對豆芋蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽的整體效果較好。從表中還可以看出相對于超濾組分IV，各組分的ACE抑制率都有較大提高，不同濃度乙醇洗脫的組分ACE抑制率不同，隨著乙醇濃度的增加，洗脫下來的具有ACE抑制活性的豆芋多肽越多，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，洗脫液的ACE抑制活性最高，為66.65%，但當(dāng)乙醇濃度在90%時(shí)，ACE活性抑制率有所下降，這說明ACE抑制率與豆芋多肽疏水性沒有太大的相關(guān)性。

表2 不同濃度乙醇洗脫組分的肽得率，脫鹽率及ACE抑制率Table 2 The peptide recovery ration，desalinization ration and ACE inhibition activity in different elution fractions

2.3 離子交換色譜DEAE-SepHarose Fast Flow的分離純化結(jié)果

如圖1所示，大越豆芋ACE抑制肽經(jīng)DEAESepHarose Fast Flow陰離子交換樹脂分離后大致將產(chǎn)物分為3個(gè)峰，分別依次命名為G1、G2、G3。本實(shí)驗(yàn)采用同步洗脫的方式對肽類物質(zhì)進(jìn)行分離，由于被吸附的肽分子的種類不同，它們所帶的電荷量也不相同，因此與介質(zhì)的結(jié)合牢固程度不同，這樣在洗脫的過程中，較容易被替換的肽分子先從介質(zhì)上脫離流出層析柱，較難被替換的肽分子后流出，這樣就達(dá)到了分離純化的目的［21］。

圖1 DEAE-SepHarose Fast Flow洗脫曲線Fig.1 The eluting curve of DEAE-SepHarose Fast Flow

將三個(gè)峰合并收集以后濃縮凍干，分別在不同濃度下測定ACE抑制活性。各個(gè)峰的抑制活性見圖2，其中G3曲線擬合斜率最大，表示G3的抑制率在一定多肽濃度范圍內(nèi)上升最快。根據(jù)三個(gè)峰各自不同的ACE抑制率隨濃度變化曲線計(jì)算出三個(gè)峰的IC50，結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果可知，G3的IC50最小，為66.00μg/mL，說明其ACE抑制活性最高，其次G1，它的IC50是178.1μg/mL，G2的 ACE抑制活性最低;三個(gè)洗脫峰的活性相差較大，說明了DEAE-SepHarose Fast Flow對ACE抑制活性肽純化效果較好。

圖2 G1、G2、G3 ACE抑制率隨濃度的變化Fig.2 The change of ACE inhibition activity with solution concentration of G1，G2，G3

表3 DEAE-SepHarose Fast Flow三個(gè)峰ACE抑制率的IC50Table 3 The IC50of three elution peaks of DEAE-SepHarose Fast Flow

2.4 SepHadex G-15分離脫鹽豆芋ACE抑制肽

采用SepHadex G-15凝膠色譜對ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，得到的洗脫曲線見圖3。從圖中可知，ACE抑制肽經(jīng)過凝膠色譜SepHadex G-15的分離純化，出現(xiàn)兩個(gè)峰，分別命名為F1和F2，分別將F1和F2兩個(gè)峰各自合并后冷凍干燥，測定它們不同濃度的ACE抑制活性，結(jié)果見圖4，圖4中F2的斜率較大，表明F2在豆芋多肽一定濃度范圍內(nèi)比F1抑制效果要好。根據(jù)結(jié)果計(jì)算兩個(gè)洗脫峰ACE抑制活性的IC50見表4。由表4可以看出，峰2的抑制活性較好，其 IC50可以達(dá)到 37.47μg/mL。經(jīng)過 SepHadex G-15凝膠色譜純化后的ACE抑制肽的抑制活性有所提高，說明SepHadex G-15對ACE抑制肽進(jìn)行了進(jìn)一步純化。

圖3 SepHadex G-15的洗脫曲線Fig.3 The eluting curve of SepHadex G-15

3 結(jié)論

圖4 F1、F2 ACE抑制活性隨濃度的變化Fig.4 The change of ACE inhibition activity with solution concentration of F1，F(xiàn)2

大越豆芋蛋白經(jīng)Alcalase蛋白酶酶解后，采用超濾分離、DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽處理、DEAESepHarose Fast Flow離子交換色譜法、SepHadex G-15凝膠色譜法分離等手段，其分離獲得的組分ACE抑制率都具有不同程度的升高。超濾分離得到3ku的豆芋多肽抑制率為62.32%，比原液高出了9.86%;大孔吸附樹脂脫鹽采用70%乙醇洗脫出來的組分具有最高的ACE抑制率，抑制率為66.65%。DEAE-SepHarose Fast Flow離子交換層析法分離獲得的 G3組分 IC50達(dá)到 66.0μg/mL。最后采用SepHadex G-15凝膠色譜法分離獲得兩個(gè)組分，通過測定不同濃度樣品的ACE抑制率得到抑制效果最為顯著的組分 F2，其IC50可達(dá)37.47μg/mL。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來看，本實(shí)驗(yàn)初步制備了具有ACE降血壓活性的大越豆芋多肽。為了更清楚的了解其作用機(jī)理，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，從而制備出ACE抑制肽單體，研究其構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理。大越豆芋降血壓活性的研究為推動(dòng)這種新食品資源的開發(fā)利用提供了有力的依據(jù)。

表4 SepHadex G-15兩個(gè)洗脫峰ACE抑制率的IC50Table 4 The IC50of the tow elution peak of SepHadex G-15

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