食品中空腸彎曲菌檢測(cè)技術(shù)最新進(jìn)展

胡元慶，李鳳霞

(閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000)

彎曲菌是一種革蘭氏陰性桿菌，能引起散發(fā)性和地方流行性的人類胃腸炎，特殊血清型的空腸彎曲菌對(duì)具有免疫缺陷性的人群，如癌癥病人、艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，危害更加嚴(yán)重［1］。彎曲菌性腸炎潛伏期約為17d，主要臨床癥狀包括發(fā)熱、腹痛、水樣或粘液血性腹瀉以及嘔吐等［2］。另外，空腸彎曲菌被認(rèn)為是人類格林－巴利綜合征(Guillain－Barré syndrome，GBS)最主要的前驅(qū)致病因子［1］，發(fā)病主要是由于空腸彎曲菌的菌體成分可以與宿主的神經(jīng)節(jié)苷酯發(fā)生分子模擬，導(dǎo)致病人神經(jīng)麻痹甚至癱瘓，嚴(yán)重威脅到人類的健康［3－5］。20世紀(jì) 90年代國(guó)內(nèi)對(duì)彎曲菌檢測(cè)的研究報(bào)道較少，主要由于彎曲菌病的發(fā)生較罕見，畜禽病死率低，以及彎曲菌培養(yǎng)條件比較苛刻等原因。近年來，彎曲菌的感染率在世界各地呈上升趨勢(shì)，特別是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的禽肉食品污染比較嚴(yán)重［6］。發(fā)展中國(guó)家空腸彎曲菌污染食品的案例報(bào)道相對(duì)較少，主要是引起部分人群的腹瀉及腸炎，但隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，空腸彎曲菌污染肉類食品的事件逐年增多［6］。建立空腸彎曲菌快速特異的分離檢測(cè)方法，提高食品中空腸彎曲菌的檢出效率，可有效控制畜產(chǎn)品在生產(chǎn)和消費(fèi)中受空腸彎曲菌的污染，有助于從根本上預(yù)防控制人畜共患空腸彎曲菌病的發(fā)生。本文將綜述空腸彎曲菌檢測(cè)方法及技術(shù)的最新研究進(jìn)展。

1 常規(guī)分離鑒定方法

空腸彎曲菌的體外培養(yǎng)需要較為苛刻的條件，尤其要求嚴(yán)格的氣體環(huán)境。早在1957年King等就已發(fā)現(xiàn)彎曲菌與人類腸炎的發(fā)生密切相關(guān)，但直到Skirrow和Blaster使用能抑制腸道中背景菌群的培養(yǎng)基后，該屬細(xì)菌的檢出率才得以提高［7］。

彎曲菌常規(guī)分離鑒定方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性分離和生化鑒定。革蘭氏染色、細(xì)菌動(dòng)力觀察、過氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等可將彎曲菌鑒定到屬的水平。而更精確的種特異性鑒定則需要做更多的生化試驗(yàn)，如硝酸鹽水解試驗(yàn)、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)、吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)、萘啶酸和頭孢菌素敏感性試驗(yàn)等。確定彎曲菌的屬后，可使用API Campy生化鑒定試劑盒或VITEK－NH生化鑒定卡來進(jìn)行種特異性鑒定［8］。近年來，還出現(xiàn)了 Micro－ID 系統(tǒng)、Enterotube系統(tǒng)和Mnitek系統(tǒng)等，從而使得空腸彎曲菌鑒定更簡(jiǎn)易化、微量化和快速化。用生化方法鑒別空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的唯一指標(biāo)是馬尿酸鹽水解試驗(yàn)，其中空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗(yàn)呈陽性。也有報(bào)道顯示，約10% 的空腸彎曲菌分離株在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下失去分解馬尿酸鹽的能力［9］。盡管生化方法是目前微生物學(xué)手段鑒定空腸彎曲菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實(shí)際應(yīng)用中很難保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 核酸檢測(cè)方法

2.1 基因芯片

基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因序列分析、雜交、基因突變檢測(cè)和多態(tài)性分析、基因組文庫圖型分析以及疾病的基因診斷等領(lǐng)域。該技術(shù)可將大量不同的探針固定于同一支持物上，一次性對(duì)同一樣品進(jìn)行序列監(jiān)測(cè)和核酸分析［10－11］。Georgios Keramas 等［12］使用一種敏感的DNA芯片快速檢測(cè)泄殖腔拭子樣品中的彎曲菌。姜海等［13］利用細(xì)菌種屬特異性基因、重要毒力基因以及目前已經(jīng)可區(qū)分菌株亞型的基因作為靶基因探針制備基因芯片，并通過雜交反應(yīng)檢測(cè)常見腸道致病菌。王金玲等［14］依據(jù) 16S rRNA、23S rRNA上的恒定區(qū)和可變區(qū)設(shè)計(jì)7種致病菌的通用引物和特異性寡核苷酸探針，并對(duì)探針5'端氨基化修飾后與基因芯片共價(jià)結(jié)合，然后優(yōu)化雜交反應(yīng)液、芯片點(diǎn)樣及后處理程序，研制出能同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物性食品中7種主要致病菌的基因芯片。國(guó)內(nèi)尤元海等［15］依據(jù)不同腸道病原菌毒力基因建立了一種基因芯片方法，可以檢測(cè)大腸桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌和腸炎耶爾森氏菌，該技術(shù)具有高效快速實(shí)用等特點(diǎn)，尤其適合檢測(cè)腹瀉病人的感染菌?；蛐酒夹g(shù)雖然有多方面的優(yōu)越性，但在實(shí)際應(yīng)用中存在檢測(cè)成本高、設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格等的局限性，所以不能廣泛用于基層單位的檢測(cè)工作。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加上兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，它具有高效、系統(tǒng)和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，所以在多種病原微生物的同步檢測(cè)和鑒定方面得到廣泛應(yīng)用。常選用的靶基因有16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因(ceuE)、細(xì)胞擴(kuò)張毒素基因 cdt等［16］。Van Camp G H等［17］使用PCR的方法擴(kuò)增彎曲菌的16S rRNA基因?qū)υ摷?xì)菌進(jìn)行鑒定。何蕊等［18］以16S rRNA、mapA和ceuE為靶基因，建立檢測(cè)空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的多重PCR方法。同時(shí)使用該方法對(duì)180份生鮮雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出空腸彎曲菌陽性樣品43份，結(jié)腸彎曲菌陽性樣品12份。結(jié)果表明，多重PCR方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化鑒定和血清學(xué)方法的不足，為彎曲菌檢測(cè)提供新的技術(shù)。國(guó)內(nèi)侯建軍等［19］以空腸彎曲菌VS1基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了能與其他食品污染菌相區(qū)別的PCR檢測(cè)方法，其靈敏度達(dá)6CFU/mL，該方法具有高效、靈敏、特異和穩(wěn)定的特點(diǎn)。

近年出現(xiàn)了多重PCR的改進(jìn)方法，如多重PCR－變性高效液相色譜(mPCR－ HPLC)［20］。與常規(guī)mPCR－凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)不同，mPCR－HPLC經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，使用DHPLC技術(shù)分辨分子大?。?1］。根據(jù)分子對(duì)固定相親和力的差異，用流動(dòng)相洗脫時(shí)不同大小或者不同序列的核苷酸分子在固定相上移動(dòng)速率不同檢測(cè)目的片段。該技術(shù)靈敏度和特異性較高，產(chǎn)物分子量1%大小的片段即能夠被分離檢出，克服了凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)中產(chǎn)物條帶較弱，擴(kuò)增片段大小相近時(shí)，難以肉眼準(zhǔn)確判定結(jié)果的不足。Franciosa等［22］報(bào)道了利用變性高效液相色譜鑒定肉毒桿菌神經(jīng)毒素A、B、E和F型基因的研究，并指出DHPLC技術(shù)可以用于食品病原微生物的檢測(cè)。曹際娟等［23］在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了用DHPLC進(jìn)行的微生物檢測(cè)研究，對(duì)動(dòng)物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行高通量檢測(cè)。徐君怡等［24］采用非變性DHPLC技術(shù)，建立了食品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的特異性吸收譜圖，利用mPCR－DHPLC方法對(duì)彎曲菌進(jìn)行快速檢測(cè)的研究。PCR技術(shù)與其它相關(guān)生物檢測(cè)手段聯(lián)合使用，是其發(fā)揮穩(wěn)定性和特異性的新方向，未來開發(fā)的重點(diǎn)應(yīng)是適合基層檢測(cè)應(yīng)用的聯(lián)合新技術(shù)開發(fā)和優(yōu)化，使檢測(cè)范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，檢測(cè)成本保持較低水平。

2.3 套式PCR

套式PCR是用內(nèi)、外兩套引物進(jìn)行兩次PCR，第一次PCR產(chǎn)物作為第二次PCR的模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，該方法克服了一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)量低而造成假陰性的缺點(diǎn)，大大提高了PCR擴(kuò)增的靈敏度。高正琴等［25］建立了套式PCR檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，并初步應(yīng)用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空腸彎曲菌進(jìn)行檢測(cè)，最低限度為10CFU/mL，整個(gè)檢測(cè)過程在8h內(nèi)完成，從121份臨床樣品中共檢出31份陽性，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法一致。該方法與常規(guī)PCR方法相比，可從極少量模板中獲得高濃度和高純度的靶基因片段，其敏感性較常規(guī)PCR提高100倍以上。

2.4 PCR－ELISA

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們不再滿足于PCR的定性測(cè)定，在凝膠電泳的基礎(chǔ)上使用掃描照片進(jìn)行光密度分析，實(shí)現(xiàn)PCR的相對(duì)定量。但由于普通凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)本身的特異性較低，只能對(duì)樣品進(jìn)行粗略的相對(duì)定量。隨著固相捕獲技術(shù)的成熟和應(yīng)用，尤其是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的成功，給核酸定量提供了一個(gè)新思路，固相捕獲的PCR－ELISA技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。經(jīng)PCR擴(kuò)增以后，在微孔板上借用ELISA的原理，用酶標(biāo)抗體進(jìn)行固相雜交來實(shí)現(xiàn)定量［26］。Sails A D 等［27］使用 CJ2 和CC2 兩個(gè)探針來檢測(cè)彎曲菌。用同一對(duì)引物擴(kuò)增目的基因，PCRELISA的靈敏度比以凝膠為基礎(chǔ)的PCR高10～100倍，其靈敏度可達(dá)到1.5fg DNA。結(jié)果表明該方法具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，并大大降低了鑒定彎曲菌所需的時(shí)間，可用于食品和環(huán)境樣品中彎曲菌的檢測(cè)。

2.5 Real－time PCR

Real－time PCR即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是在PCR基礎(chǔ)上建立的一項(xiàng)新技術(shù)，由于它具有操作簡(jiǎn)便、快速高效的特點(diǎn)，同時(shí)具有很高的敏感性和特異性，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。Real－time PCR在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來實(shí)時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。該技術(shù)使用的熒光探針有分子信標(biāo)、Taqman探針和SYBR Green I等。其中分子信標(biāo)和Taqman探針法的熒光信號(hào)是特異的，檢測(cè)成本也較高;而SYBR Green I法中的熒光信號(hào)是非特異的，通過熒光染料與dsDNA的結(jié)合而發(fā)出熒光，繼而通過儀器自動(dòng)檢測(cè)出熒光信號(hào)增長(zhǎng)曲線［28］。

Chengbo Yang等［29］建立實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不經(jīng)增菌處理的禽肉食品、牛奶和環(huán)境水樣中的彎曲菌。整個(gè)反應(yīng)在1h之內(nèi)完成，且最低檢出限為1CFU/mL。在300份禽肉樣品中檢出92份空腸彎曲菌陽性，300份牛奶樣品中檢出82份空腸彎曲菌陽性，300份環(huán)境水樣中檢出41份空腸彎曲菌陽性。Emma L.Best等［30］也建立了快速、特異、敏感的方法來對(duì)空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行檢測(cè)。Josefsen等［31］建立了一種細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)合Real－time PCR檢測(cè)雞肉樣品中空腸彎曲菌的技術(shù)，可在3h內(nèi)檢測(cè)到活的或者VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，但不能檢測(cè)死亡彎曲菌的 DNA。Leblanc－Maridor M 等［32］建立了從糞便、食品和環(huán)境樣品中檢測(cè)空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的Real－time PCR方法，其靈敏度可達(dá)10個(gè)基因組拷貝，能作為研究彎曲菌流行病學(xué)的可靠技術(shù)。

3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

3.1 IMC－FPCR

免疫磁性分離技術(shù)(Immunomagnetic Separation，IMS)是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合形成抗原－抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在磁場(chǎng)的作用下定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的。IMC－FPCR為磁珠捕獲－熒光PCR，它是應(yīng)用抗血清和磁性微珠制備彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠來捕獲檢樣中目的菌的特定基因［33］。它具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)且抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)而得到應(yīng)用，該方法可望解決非可培養(yǎng)狀態(tài)空腸彎曲菌檢測(cè)的難題。Liu G等［34］針對(duì)flaA基因hipO基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立磁珠捕獲－熒光PCR檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，對(duì)300份食品樣品和100份水樣品進(jìn)行檢測(cè)，在食品樣品中檢測(cè)出4份陽性，結(jié)果與傳統(tǒng)的方法一致;在100份水樣品中檢測(cè)出1份陽性，而傳統(tǒng)方法沒有檢出陽性，同時(shí)該方法也可用于VBNC(存活非可培養(yǎng))狀態(tài)下空腸彎曲菌的檢測(cè)。David F等［35］建立磁捕獲－熒光PCR對(duì)食品中的空腸彎曲菌進(jìn)行檢測(cè)，可檢出的最少細(xì)菌數(shù)，比不用MS富集的方法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。隨著科學(xué)的發(fā)展，免疫磁珠還可以與熒光定量PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)等結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特殊的檢測(cè)目的，為彎曲菌的檢測(cè)提供更加高效的手段。

3.2 ELISA

Taylor等［36］用空腸彎曲菌 NCTC11168的主要外膜蛋白制備了多價(jià)血清并建立了ELISA檢測(cè)方法，這種多價(jià)血清可以和空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和海鷗彎曲菌三種彎曲菌反應(yīng)。Griffiths等［37］利用種特異性多價(jià)血清建立了Dot－ELISA方法，可以區(qū)分空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和海鷗彎曲菌。黎誠耀等［38］以方陣滴定法確定了空腸彎曲桿菌抗血清、酶結(jié)合物的最佳工作濃度和孵育時(shí)間，從而建立了快速檢測(cè)空腸彎曲菌的間接ELISA方法，對(duì)144份雞泄殖腔糞便標(biāo)本和116份豬直腸糞便標(biāo)本的選擇性增菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行了檢測(cè)，陽性率分別為83.3%和79.3%，可于28h內(nèi)報(bào)告結(jié)果。黎誠耀等［39］還應(yīng)用酶標(biāo)抗體染色法檢測(cè)空腸彎曲菌，結(jié)果表明該方法具有較高的特異性及敏感性，在對(duì)47份雞糞便樣本和38株豬糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果相同，該空腸彎曲菌的酶標(biāo)抗體染色檢測(cè)法可在2h內(nèi)完成。

另外，許多學(xué)者研制了針對(duì)彎曲菌多種抗原的單克隆抗體，以此建立ELISA的檢測(cè)方法。Monfort J D［40］建立了基于空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌鞭毛抗原單克隆抗體的ELISA方法，可以直接從泄殖腔棉拭子中檢測(cè)彎曲菌。Steele［41］制備了針對(duì)空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解酶的單克隆抗體，結(jié)果表明其特異性較好。Brooks［42］制備了針對(duì)LPS的單克隆抗體，特異性較好。韓文瑜等［43］應(yīng)用空腸彎曲菌共同抗原的單克隆抗體，以BA－ELISA法對(duì)雞和豬的胴體表面、臟器及泄殖腔樣本中的空腸彎曲菌進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明該方法具有較強(qiáng)的特異性和敏感性。

4 噬菌體受體蛋白捕獲技術(shù)

Amit Singh等［44］建立了用噬菌體受體結(jié)合蛋白捕獲空腸彎曲菌的技術(shù)，GP48RBP蛋白首先通過谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的方式得以表達(dá)，然后被固定到等離子表面共振器上，用其捕獲待檢樣品中的細(xì)菌。結(jié)果表明:該技術(shù)具有較好的捕獲特異性，最低檢測(cè)限為102CFU/mL。后續(xù)的研究也將該技術(shù)與磁珠結(jié)合，用于捕獲未被濃縮的檢測(cè)樣品。Muhammad A.Javed等［45］對(duì)空腸彎曲菌的噬菌體NCTC12673全基因組進(jìn)行了分析，確定了GP047是結(jié)合宿主的重要受體蛋白，對(duì)該蛋白C－端四分之一氨基酸區(qū)表達(dá)(CC GP047)，然后用其在玻片上積聚彎曲菌，這個(gè)積聚過程可以再幾分鐘內(nèi)完成，其對(duì)彎曲菌的特異性識(shí)別達(dá)到100%，其中對(duì)空腸彎曲菌的特異性為95%，對(duì)結(jié)腸彎曲菌為90%。然后對(duì)CC GP047表達(dá)為綠色熒光融合蛋白，可以通過熒光顯微鏡來分析被吸附的彎曲菌。

5 展望

人感染彎曲菌的主要途徑是食用未煮熟的禽肉，通常為散發(fā)。彎曲菌病的爆發(fā)主要由飲用污染的水源或牛奶引起。由于空腸彎曲菌對(duì)環(huán)境的抵抗力較弱，不管是哪種途徑感染，污染的樣品攜帶空腸彎曲菌的數(shù)量都很低，給空腸彎曲菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估帶來一些困難。目前，較為實(shí)用的檢測(cè)方法是細(xì)菌分離培養(yǎng)配合PCR鑒定，檢測(cè)快速且成本相對(duì)較低，但經(jīng)常有漏檢的情況發(fā)生。所以開發(fā)更靈敏、更特異、更快速的彎曲菌檢測(cè)方法是預(yù)防該菌感染人的重要手段。近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、電化學(xué)的快速發(fā)展，尤其是幾種學(xué)科的交叉研究，新的彎曲菌檢測(cè)方法不斷產(chǎn)生。未來對(duì)空腸彎曲菌檢測(cè)方法的研究主要關(guān)注以下幾個(gè)方面:為克服細(xì)菌含量低而開發(fā)的新型富集方法和前增菌方法;空腸彎曲菌新的、更特異檢測(cè)抗原的發(fā)現(xiàn);高通量檢測(cè)方法的建立，如基因芯片方法等。

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