雙孢菇深層發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究

劉曉鵬，姜 寧，馬 瓊，楊 洪，余麗瓊，張 馳

(1．湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000;2．生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000)

雙孢菇(Agaricus bisporus)屬于真菌界、擔子菌門、無隔擔子菌綱、傘菌目、傘菌科、蘑菇屬，又名口蘑、洋蘑菇、白蘑菇、圓蘑菇。雙孢菇的野生資源分布于歐洲、北非、北美洲和澳大利亞等地［1］。

雙孢菇營養(yǎng)價值高，含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質，蛋白質含量可達40%，含有多種氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸，賴氨酸和亮氨酸含量豐富，含有豐富的維生素［2-3］。雙孢菇為藥食同源的食用菌，味甘性平，具有降血壓、提神消化的作用。常食用雙孢菇，能預防壞血病、腫癌，促進傷口愈合，并對肝炎、肝硬化具有輔助療效［4-8］。將雙孢菇的多糖、活性肽、氨基酸等活性成分提取出來可開發(fā)為藥物或保健品。

雙孢菇菌蓋表面沒有保護結構，不能阻止外界的物理傷害、微生物侵染，加之雙孢菇呼吸速率高及含水量多，使得雙孢菇極易腐爛和褐變［9］，不利于雙孢菇生理活性物質的提取獲得，而且子實體的人工栽培周期長，費工費時。利用液體深層培養(yǎng)菌絲體具有培養(yǎng)周期短、標準化操作、規(guī)模化生產等優(yōu)點，通過液體發(fā)酵可以快速得到雙孢菇的菌絲體和生理活性物質，毛勇等［10］研究了碳源、氮源、無機鹽對雙孢菇胞外多糖產量的影響，王敏等［11］研究了不同碳氮源對雙孢菇深層發(fā)酵的影響，目前尚未見有系統(tǒng)研究雙孢菇深層發(fā)酵工藝的報道。

本研究通過對雙孢菇深層發(fā)酵工藝的優(yōu)化，為大規(guī)模發(fā)酵雙孢菇獲取菌絲體和生理活性物質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 由市售的新鮮雙孢菇子實體中分離所得，經(jīng)姜寧副教授鑒定為雙孢菇(Agaricus bisporus)。培養(yǎng)基配方 固體斜面種子培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，蔗糖2%，瓊脂2%，pH自然?；罨囵B(yǎng)基:同斜面培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖1%，麥芽糖 1% ，MgSO40．15% ，K2HPO40．1% ，pH7．0。

HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱 大倉市實驗設備廠;SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司;YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;電熱恒溫干燥箱 上海?，攲嶒炘O備。

1.2 實驗方法

1．2．1 工藝流程 菌種活化→液體種子→液體發(fā)酵→過濾發(fā)酵液，得菌絲體→清洗菌絲體→干燥→稱菌絲干重

1．2．2 操作步驟 在無菌條件下，用接種鏟從斜面菌種上切取1cm2的菌塊接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，26℃恒溫培養(yǎng)6d，挑選菌絲潔白、粗壯、濃密、無污染的斜面作為供試菌種。按上述步驟將斜面種子接至液體種子培養(yǎng)基上，26℃恒溫振蕩培養(yǎng)6d。吸取一定量的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃、120r/min培養(yǎng)6d。將發(fā)酵醪用4層紗布過濾，并用蒸餾水進行反復沖洗，105℃烘2h，冷卻后稱重，再放入105℃中烘30min再稱重。直至兩次稱重的重量差不超過2mg即為恒重。

1．2．3 液體培養(yǎng)基優(yōu)化

1．2．3．1 單因素實驗 以可溶性淀粉3%、黃豆粉3%(煮沸30min，4層紗布過濾取濾液，以下黃豆粉處理相同)、KH2PO40．05% 、MgSO40．05% 為基本培養(yǎng)基，調整碳源、氮源、無機鹽和維生素進行單因素實驗。如碳源單因素實驗分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉為碳源;氮源則分別以蛋白胨、酵母膏、麩皮、黃豆粉、尿素、(NH4)2SO4、NaNO3為氮源;無機鹽單因素實驗分別將 KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、FeSO4作為無機鹽;而維生素的因素實驗分別將 VB1、VB2、VB6、VB1+VB2、VB1+VB6、VB2+VB6和 VB1+VB2+VB6作為生長因子。以獲得培養(yǎng)雙孢菇菌絲體最佳碳源、氮源、無機鹽和維生素。

1．2．3．2 均勻設計實驗 根據(jù)單因素實驗結果選取最佳碳源、氮源、無機鹽、生長因子，采用均勻設計表，每一因素取8水平。實驗設計見表1。

1．2．4 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化 在預實驗的基礎上，以接種量、發(fā)酵溫度、轉速為實驗因子，以菌絲體干重作為指標，采用中心復合設計，各因子水平及編碼表見表2。

表1 均勻設計實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of U8uniform design

表2 實驗因素水平編碼表Table 2 Factor and coded levels of experiment

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復三次，單因素和均勻設計實驗的數(shù)據(jù)用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件分析，組間多重比較用最小顯著差異(Least Significant Difference，LSD)法;中心復合設計實驗用Design Expert 8．0進行分析。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化實驗結果

2．1．1 不同碳源對菌絲生長的影響 碳源濃度均為3%，碳源篩選實驗的 F 值 =18．927 ＞ F0．01(=4．456)，說明不同碳源對菌絲體產量的作用差異是極顯著的。LSD法進行多重比較，結果見表3。由表3可知可溶性淀粉作為碳源時，菌絲生長量最大，且和其它碳源作用的差異達極顯著水平，麥芽糖、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇之間差異不顯著。這是由于雙孢菇為大型真菌，生長周期長，單糖、雙糖代謝過快，不適應雙孢菇的生長需要，而多糖類碳源需經(jīng)菌體產生的胞外酶水解成單糖后再被利用，能提供長期營養(yǎng)，所以適合雙孢菇的生長需要。

2．1．2 不同氮源對菌絲體生長的影響 氮源濃度均為 3%，對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，F(xiàn)=119．037 ＞ F0．01(=4．46)，說明不同氮源對菌絲生長量有極顯著差異影響。對數(shù)據(jù)進行多重比較(LSD法)，由表4可以得出:雙孢菇對有機氮的利用明顯好于無機氮，其中蛋白胨的菌絲體干重明顯高于其他氮源，而酵母膏、麩皮和黃豆粉之間差異不顯著，(NH4)2SO4、NaNO3和尿素上的菌絲體幾乎不長，之間的差異也不顯著。說明雙孢菇本身不能直接利用無機氮合成某些氨基酸，需從有機氮源中攝?。?2］。

2．1．3 不同無機鹽對菌絲體生長的影響 所有無機鹽加入量均為0．05%，無機鹽篩選實驗結果的F=6．997 ＞ F0．01(=5．064)，表明不同的無機鹽會對菌絲體生長量產生極顯著影響。采用LSD法進行多重比較(表 5)，可以看出:KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4對菌絲生物量的影響無顯著差異，MgSO4與FeSO4、KCl之間存在顯著差異，無機鹽為FeSO4時菌絲體干重顯著小于其他無機鹽。下面實驗中選用KCl。

表3 不同碳源對菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 3 Difference signification of carbon source effect on dry mycelia yield by LSD

表4 不同氮源對菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 4 Difference signification of nitrogen source effect on dry mycelia yield by LSD

表5 不同無機鹽對菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 5 Difference signification of inorganic salt effect on dry mycelia yield by LSD

表6 不同維生素對菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 6 Difference signification of vitamin effect on dry mycelia yield by LSD

2．1．4 不同維生素對菌絲體生長的影響 維生素均加入10mg/100mL，計算實驗結果的 F值 =6．031＞F0．01(=4．46)，即不同維生素對菌絲體生長影響差異達極顯著水平，采用LSD法對數(shù)據(jù)進行多重比較(表6)，得出VB1對菌絲體生長最有利，它與其他維生素之間作用差異達顯著水平，其他維生素之間無顯著差異。

2．1．5 均勻設計實驗結果與分析 對均勻設計實驗結果(表7)利用SPSS軟件進行回歸處理，得出如下回歸方程

式中 y 表示菌絲體干重(g/100mL)，x1、x2、x3、x4分別表示可溶性淀粉、蛋白胨、KCl、VB1的濃度。

R=0．995，R2=0．990，F(xiàn)=72．704 ＞ F0．01(4，3)=28．71，P=0．003，說明建立的回歸方程具有顯著的線性關系。對各因素的偏回歸系數(shù)進行t檢驗(表8)，可以得知四個因素對菌絲體產量存在著顯著影響，主次順序為1/x1＞x2＞x4＞x3。

根據(jù)回歸方程:菌絲體產量與可溶性淀粉的含量倒數(shù)呈負相關，與蛋白胨、VB1的濃度呈正相關，與KCl濃度呈負相關，所以，可溶性淀粉的濃度取實驗濃度的上限即4．6%，蛋白胨取上限4．6%，KCl取下限0．02%，VB1取上限 18mg/100mL，將上述數(shù)據(jù)代入方程中，得出理論菌絲體干重為2．561g/100mL。

雙孢菇的菌絲體產量與1/x1成一定的比例關系，如設A=x2/x1(即氮碳比)，上述線性方程可換算成:

這就直接證明了微生物生長量不僅與氮源、碳源含量有關，而且與它們的比值相關，在研究白靈菇深層發(fā)酵也發(fā)現(xiàn)了相同的規(guī)律［13］。

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進行驗證實驗，所得菌絲體干重平均達2．602g/100mL，與預測值相符，優(yōu)于均勻設計實驗的所有組合實驗值。

表7 均勻設計實驗結果Table 7 Results of uniform design experiment

表8 各偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗Table 8 Significance test of partial regression coefficients

2.2 中心復合設計實驗結果與分析

2．2．1 回歸模型的建立 運用 Design Expert 8．0對中心復合設計實驗結果(表9)進行分析，得出的回歸方程如下:

Y=3．052+0．085X1+0．168X2+0．086X3+0．047X1X2+0．036X1X3+0．137X2X3-0．132X12-0．351X22-0．146X32

其中 R2=0．960，F(xiàn)=26．56，p ＜0．0001，極顯著;失擬性實驗 F=1．02，p 值為 0．49，不顯著，證明所建的回歸方程擬合得很好。

2．2．2 各因子主次關系 方差分析結果(表10)表明:除X1X2，X1X3項外其余各項作用均達顯著水平，根據(jù)回歸方程中偏回歸系數(shù)絕對值大小和F值，可以得到各因子和交互作用的主次順序為:X22＞X2＞X32＞X2X3＞X12＞X3＞X1＞X1X2＞X1X3。

由于X1X2，X1X3項作用不顯著，所以需將上述回歸方程中這二項刪除。

2．2．3 各因子組合的優(yōu)化 根據(jù)已刪除不顯著項的回歸方程，計算出 X1=0．32、X2=0．33、X3=0．45，將各因子的編碼值換算成自然變量，即接種量11%、發(fā)酵溫度26℃、轉速 143r/min時，Y達最高值 3．113g/100mL。對優(yōu)化的工藝進行驗證，得出菌絲體干重達3．125g/100mL，說明得出的最佳工藝有很好的實用性。

2．2．4 響應面分析 圖1為響應面分析圖，從中可以直觀看出各因子對響應值影響的變化趨勢。圖1A為當轉速為143r/min時，隨著接種量的加大和發(fā)酵溫度的上升，菌絲體產量逐步提高，當達到一定水平時，產量不再上升，反而會下降;當發(fā)酵溫度為26℃時，接種量和轉速對菌絲體干重的影響如圖1B所示，在接種量和轉速在最優(yōu)水平以下時，菌絲體干重隨因子數(shù)值的增加而增加，到達最優(yōu)水平以后，響應值下降。當接種量為11%時，發(fā)酵溫度和轉速對響應值的影響與以上分析相同(圖1C)。

圖1 雙孢菇液體發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面分析Fig．1 Response surface analysis of optimization of liquid fermentation for Agaricus bisporus

3 結論

通過單因素實驗篩選出雙孢菇的最佳碳源、氮源、無機鹽和維生素分別為可溶性淀粉、蛋白胨、KCl和VB1。通過均勻設計實驗確定了雙孢菇深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉4．6%、蛋白胨4．6%、KCl 0．02%，VB118mg/100mL，理論預計值為2．561g/100mL，這一結論得到驗證。中心復合設計實驗的結果表明雙孢菇溶層發(fā)酵的最佳工藝是:接種量11%、發(fā)酵溫度26℃、轉速143r/min時，此時菌絲體干重達3．112g/100mL。驗證結果顯示菌絲體干重達3．125g/100mL，與未優(yōu)化的配方和工藝相比，產量提高了202%，說明得出的最佳工藝有很好的實用性。

［1］王賀祥主編．食用菌學［M］．北京:中國農業(yè)大學出版社，2004:120-121．

［2］吳素玲，孫曉明，王波，等．雙孢菇子實體營養(yǎng)成分分析［J］．中國野生植物資源，2006，2(2):47-52．

［3］高宏偉，吳華．雙孢菇子實體氨基酸和不飽和脂肪酸分析［J］．檢驗檢疫科，2003，13(2):15-16．

［4］張強，宮璐嬋，孟凡榮，等．雙孢菇多糖抗氧化活性的研究［J］．中國林副特產，2010，104(1):16-19．

［5］常海蘭，殷鳳．雙孢菇的抗氧化作用及對免疫功能影響的研究［J］．山西醫(yī)科大學學報，2003，34(2):122-123．

［6］Kozarski M，Klaus A，Niksic M，et al．Antioxidative and immunomodulating activities of polysaccharide extracts of the medicinal mushrooms Agaricus bisporus，Agaricus brasiliensis，Ganoderma lucidum and Phellinus linteus［J］．Food Chemistry，2011，129(4):1667-1675．

［7］Ruthes A C，Rattmann Y D，Carbonero E R，et al．Structural characterization and protective effect against murine sepsis of fucogalactans from Agaricus bisporus and Lactarius rufus［J］．Carbohydrate Polymers，2012，87(2):1620-1627．

［8］Jeong S C，Koyyalamudi S R，Pang G．Dietary intake of Agaricus bisporus white button mushroom accelerates salivary immunoglobulin A secretion in healthy volunteers［J］．Nutrition，2012，28(5):527-531．

［9］卞生珍，楊清香．雙孢菇采后的生理生化變化［J］．新疆師范大學學報:自然科學版，2007，26(2):80-83．

［10］毛勇，毛健，李華鐘，等．雙孢菇深層發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化［J］．食品工業(yè)科技，2013，4:193-197．

［11］王敏，劉愛民．不同碳氮源對雙孢蘑菇2796深層發(fā)酵的影響［J］．資源開發(fā)與市場，2009，25(2):100-103．

［12］周德慶．微生物學教程［M］．北京:高等教育出版社，2011:88-89．

［13］劉曉鵬，姜寧，魏璐，等．白靈菇深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究［J］．中國釀造，2009，3:65-68．