藤椒油體外抗氧化活性研究

周 婷，蒲 彪，姜?dú)g笑，鄧應(yīng)欽

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014)

藤椒，學(xué)名竹葉花椒(Zanthoxylum armatum DC Prodr．)，又稱竹葉椒，也叫野椒、山椒，俗稱青花椒，屬于花椒屬下的花椒亞屬，是重要的調(diào)味品，具有良好的開發(fā)和利用價(jià)值［1］。藤椒油是從藤椒籽和籽皮中提取的一種口味清爽、香味濃郁、麻味綿長(zhǎng)的可食用植物油，具有藤椒特有的香麻味。其化學(xué)成分有揮發(fā)油、生物堿、脂肪酸、酰胺類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、木脂素和香豆素等。四川洪雅藤椒油是本世紀(jì)初才新興的一種調(diào)味料，具有獨(dú)特的麻香風(fēng)味。目前，四川洪雅縣是全國(guó)規(guī)模最大的藤椒種植基地［2-3］。

花椒入藥和調(diào)味，已為《本草綱目》和《中國(guó)藥典》所記載，并為世人所知，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有重要作用，并具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌防腐等功效［4-5］。但是，目前對(duì)藤椒油的抗氧化能力的研究較少，而其抗氧化能力也是其應(yīng)用必需的一個(gè)重要參數(shù)。本文通過建立體外抗氧化模型探討冷榨藤椒油和溶劑萃取藤椒油的體外抗氧化活性，以進(jìn)一步擴(kuò)展藤椒的研究范圍，以期為藤椒油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷榨藤椒油(2013年7月21號(hào)生產(chǎn))和鮮藤椒(2013年7月13號(hào)于四川省洪雅縣采集)，由四川洪雅縣幺麻子食品有限公司提供;用冷榨技術(shù)生產(chǎn)的藤椒油稱冷榨油，用溶劑萃取的藤椒油稱溶劑油。

二苯代苦味胼基自由基(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;抗壞血酸、BHT、無水乙醚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、過氧化氫、鄰苯三酚、濃鹽酸、七水合硫酸亞鐵、水楊酸等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

RE-86旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;500WHHS-2S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海光地儀器設(shè)備有限公司;180型電動(dòng)粉碎機(jī) 廣州市旭朗設(shè)備有限公司;DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 藤椒油的提取 準(zhǔn)確稱取30g粉碎至40目的藤椒粉末，裝入500mL圓底燒瓶中，以無水乙醚為提取溶劑，料液比1∶10，浸泡30min后水浴加熱，溫度40℃，進(jìn)行回流提取，時(shí)間2h(沸騰后計(jì)時(shí))，回流結(jié)束濾出提取液，向殘?jiān)性偌尤?00mL無水乙醚，重復(fù)提取2次，合并濾液，向?yàn)V液中加入適量的無水硫酸鈉去除水分，過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收有機(jī)溶劑，所得的浸膏在通風(fēng)廚中揮發(fā)剩余的有機(jī)溶劑至恒重［6］。

1．2．2 還原力測(cè)定

1．2．2．1 溶液配制 1% 鐵氰化鉀溶液:稱取 1．0g 鐵氰化鉀，用蒸餾水溶解后定容至100mL，避光保存。

2．5mmol/L HCl溶液:稱取 0．021mL 濃鹽酸定容至100mL。

0．1%三氯化鐵溶液:稱取三氯化鐵 0．05g，用2．5mmol/L HCl溶液溶解，定容至50mL，避光保存。

10%三氯乙酸溶液:稱取10g三氯乙酸，用蒸餾水溶解后定容至100mL，避光保存。

0．2mol/L pH6．6 的磷酸鹽緩沖液:取 0．2mol/L Na2HPO431．5mL 與 0．2mol/L NaH2PO468．5mL，混勻后，用 0．1mol/L 的 NaOH 及 HCl調(diào)節(jié) pH 至 6．6。

50mg/mL藤椒油溶液:分別準(zhǔn)確稱取兩種藤椒油5．00g，用丙酮定容至100mL，作為母液備用。

2mg/mL BHT 溶液:準(zhǔn)確稱取0．20g BHT，用丙酮定容至100mL，作為母液備用。

2mg/mL抗壞血酸溶液:準(zhǔn)確稱取0．20g VC，用蒸餾水定容至100mL，作為母液備用。

1．2．2．2 測(cè)定方法 將50mg/mL藤椒油溶液分別稀釋成濃度為 2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、10．0mg/mL的溶液，2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗壞血酸溶液分別稀釋成 0．02、0．03、0．04、0．05、0．06、0．07、0．08、0．10mg/mL的溶液，分別取2mL一定濃度的樣品溶液于試管中，依次加入 2．5mL 0．2mol/L pH6．6 的磷酸鹽緩沖溶液、2．5mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混合并搖勻，將混合溶液放入50℃水浴鍋中保溫20min后快速冷卻，再加入2．5mL 10%三氯乙酸，充分混勻后，在低速離心機(jī)中，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。取離心樣液的上清液5mL，再加5mL蒸餾水和1mL 0．1%三氯化鐵，充分混勻，在室內(nèi)靜置10min后在700nm處測(cè)吸光值A(chǔ)［7-8］。同時(shí)以BHT和抗壞血酸做對(duì)照。

1．2．3 清除羥自由基(·OH)能力的測(cè)定

1．2．3．1 溶液配制 8．8mmol/L H2O2:取 30%(w/w)H2O249．88mg，用蒸餾水定容至 50mL，4℃避光保存。

9．0mmol/L Fe2+(FeSO4·7H2O):稱 取 FeSO4·7H2O 250．218mg，用蒸餾水定容至 100mL。

9．0mmol/L水楊酸-乙醇溶液:稱取水楊酸124．308mg，用無水乙醇定容至 100mL。

1．2．3．2 測(cè)定方法 將50mg/mL藤椒油溶液分別稀釋成濃度為 0．5、1．0、2．0、3．0、5．0、7．0、9．0、11．0mg/mL的溶液，2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗壞血酸溶液分別稀釋成 0．005、0．05、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mg/mL的溶液，分別在10mL的試管中依次加入1mL 9mmol/L的FeSO4溶液，1mL不同濃度的樣品溶液，1mL 8．8mmol/L 的H2O2溶液，搖勻，靜置10min，再加入1mL 9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，搖勻，水浴鍋加熱至37℃反應(yīng)30min，于510nm處測(cè)其吸光值。在考慮到樣品本身的吸光值影響，分別加入1mL FeSO4溶液、不同濃度的樣品溶液和水楊酸-乙醇溶液、以及1mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值［9-10］。同時(shí)以BHT和抗壞血酸做對(duì)照。

羥自由基清除率(%)=［1-(Ax-Ax0)/A0］×100

Ax:反應(yīng)體系吸光度 Fe2++樣品+H2O2+水楊酸;Ax0:樣品本底吸光度 Fe2++樣品+蒸餾水+水楊酸;A0:空白對(duì)照 Fe2++樣品溶劑 +H2O2+水楊酸。

1．2．4 清除 DPPH·能力的測(cè)定

1．2．4．1 溶液配制 0．2mmol/L DPPH·溶液:稱取DPPH 20mg，用無水乙醇溶解后定容至250mL，4℃避光保存。

1．2．4．2 測(cè)定方法 將50mg/mL藤椒油溶液分別稀釋成濃度為 0．5、1．0、2．0、3．0、5．0、7．0、9．0、11．0mg/mL的溶液，2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗壞血酸溶液分別稀釋成 0．005、0．05、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mg/mL的溶液，分別在10mL的試管中加入2mL 0．2mmol/L DPPH·溶液，2mL不同濃度的樣品溶液，混勻后，避光靜置 30min，于 517nm 處測(cè)吸光值［11］。同時(shí)以BHT和抗壞血酸做對(duì)照。

DPPH·清除率(%)=［1-(Ax-Ax0)/A0］×100

Ax:2mL DPPH·溶液+2mL樣品溶液(加入樣液后DPPH·混合液吸光度);Ax0:2mL樣品溶液+2mL無水乙醇(本底吸光度);A0:2mL DPPH·溶液+2mL樣品溶劑(未加樣液的DPPH·吸光度)。

[7]禤燕慶、寇廣增、蔡海龍：《農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化聯(lián)合體新型經(jīng)營(yíng)主體聯(lián)合經(jīng)營(yíng)的新探索——基于安徽調(diào)查》，《農(nóng)村經(jīng)營(yíng)管理》2017年第10期。

1．2．5．1 溶 液 配 制 10mmol/L HCl 溶 液:稱 取0．084mL 濃鹽酸稀釋至100mL。

50mmol/L(pH8．2)Tris-HCl緩沖液:取 2．5g 三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶于蒸餾水中，加濃鹽酸0．8mL，定容至 100mL。

3mmol/L鄰苯三酚溶液:稱取0．0189g鄰苯三酚(焦性沒食子酸)用10mmol/L HCl溶液溶解定容至50mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用，4h內(nèi)有效。

1．2．5．2 測(cè)定方法 將50mg/mL藤椒油溶液分別稀釋成濃度為 0．5、1．0、2．0、3．0、5．0、7．0、9．0、11．0mg/mL的溶液，2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗壞血酸溶液分別稀釋成 0．005、0．05、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mg/mL的溶液，分別取1mL一定濃度的樣品溶液于試管中，各加入 4．5mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液、4．7mL雙蒸水，于25℃下恒溫反應(yīng)25min。取出試管后立即滴加0．3mL鄰苯三酚(25℃下預(yù)熱)，搖勻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量滴加鄰苯三酚后第100s時(shí)在325nm處的吸光值［12-13］。同時(shí)以BHT和抗壞血酸做對(duì)照。

超氧陰離子清除率(%)=［1-(Ax-Ax0)/(A0-A)］×100

Ax為Tris-HCl+樣品液+雙蒸水+鄰苯三酚;Ax0為Tris-HCl+樣品液+雙蒸水;A0為Tris-HCl+雙蒸水+鄰苯三酚;A為Tris-HCl+雙蒸水+HCl(0．3mL，10mmol/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藤椒油的還原力

一種物質(zhì)清除自由基能力的大小跟還原能力的大小是分不開的，在Fe3+-Fe2+氧化還原體系中，有顏色變化，所以可以通過顯色反應(yīng)來判斷還原程度，反應(yīng)后吸光度越大，還原能力越強(qiáng)，其抗氧化能力也越強(qiáng)［14］。

由圖1、圖2可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，BHT、VC、冷榨油和溶劑油的還原力都隨其質(zhì)量濃度的增加而明顯增大。在相同濃度下，溶劑油的還原力強(qiáng)于冷榨油，但與BHT和VC相比，其還原力比較弱，質(zhì)量濃度為2mg/mL的冷榨油和溶劑油的還原力與質(zhì)量濃度為0．05mg/mL的VC的還原力相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)表明，冷榨油和溶劑油具有一定的抗氧化活性。

圖1 藤椒油的還原力Fig．1 Reducing power of Zanthoxylum armatum DC Prodr．Oil

2.2 藤椒油清除羥自由基(·OH)能力

本實(shí)驗(yàn)采用水楊酸比色法，利用H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生大量高反應(yīng)活性的羥自由基，其能被水楊酸捕捉，并伴隨產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm處有最大吸收峰，具有清除羥自由基作用的物質(zhì)存在時(shí)，會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物生成量減少，吸光度降低。

圖2 BHT和VC的還原力Fig．2 Reducing power of BHT and VC

由圖3、圖4 可知，BHT、VC、溶劑油和冷榨油對(duì)·OH具有良好的清除效果，且清除作用隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈較明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在1～11mg/mL濃度范圍內(nèi)，溶劑油對(duì)·OH的清除率要高于同質(zhì)量濃度的冷榨油，體系中3mg/mL的溶劑油清除率達(dá)75%，而同濃度的冷榨油僅達(dá)43%。當(dāng)溶劑油質(zhì)量濃度達(dá)到9mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率達(dá)到89．79%，其清除效果高于1mg/mL VC對(duì)·OH(清除率71．82%)清除效果;BHT、VC、溶劑油和冷榨油對(duì)·OH的 IC50值分別為 0．9203、0．6470、1．9606 和 4．0675mg/mL。表明溶劑油和冷榨油對(duì)·OH具有一定的清除作用，但溶劑油具有更高的·OH清除能力。

圖3 藤椒油對(duì)羥自由基的清除能力Fig．3 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr．Oil on hydroxyl free radicals

圖4 BHT和VC對(duì)羥自由基的清除能力Fig．4 Scavenging effects of BHT and VC on hydroxyl free radicals

2.3 藤椒油清除DPPH·能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)孤對(duì)電子，其不同濃度的乙醇溶液呈不同程度的紫色，并在517nm附近有強(qiáng)吸收峰，自由基清除劑能與孤對(duì)電子配對(duì)，使溶液顏色由紫色向黃色變化，在517nm處的吸光度也隨之變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈一定的相關(guān)性［15］。

由圖5、圖 6 可知，在 0．2～1．0mg/mL 濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH·清除率基本無變化，都大于94%，BHT、溶劑油和冷榨油隨質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH·清除率逐漸增大，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。溶劑油對(duì)DPPH·清除率高于同濃度的冷榨油，當(dāng)溶劑油質(zhì)量濃度達(dá)到11mg/mL時(shí)清除率達(dá)到86．87%，同質(zhì)量濃度下冷榨油清除率為50．93%，遠(yuǎn)高于1mg/mL BHT清除率(44．51%)。溶劑油和冷榨油對(duì)DPPH·的 IC50值分別為 2．9465mg/mL 和 10．3052mg/mL。表明冷榨油和溶劑油具有良好的清除DPPH·能力，但溶劑油對(duì)DPPH·清除作用更明顯。

圖5 藤椒油對(duì)DPPH·的清除能力Fig．5 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr．Oil on DPPH·radicals

圖6 BHT和VC對(duì)DPPH·的清除能力Fig．6 Scavenging effects of BHT and VCon DPPH radicals

2.4 藤椒油清除超氧陰離子自由基(O-2·)能力

采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在堿性條件下迅速發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和，而生成的又對(duì)其自氧化起催化作用，中間產(chǎn)物的積累在滯后30～40s與時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，一般能維持4min左右，隨后減慢。有色中間物生成量的多少受的濃度影響，清除能減少有色產(chǎn)物的生成量，由此可測(cè)定該自由基清除劑清除的能力［16］。

由圖7、圖8可知，BHT、VC、溶劑油和冷榨油對(duì)O2-·都具有良好的清除效果，在 2．0～11．0mg/mL 濃度范圍內(nèi)，冷榨油和溶劑油對(duì)清除率相差不大，隨質(zhì)量濃度的增加增大不明顯，均大于68%，與0．6mg/mL BHT和VC的效果相當(dāng)。BHT、VC、溶劑油和冷榨油對(duì)的 IC50值分別為 0．4293、0．3934、1．6053mg/mL和0．5415mg/mL。表明冷榨油和溶劑油具有較好的清除能力。但冷榨油對(duì)清除作用更明顯。

圖7 藤椒油對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig．7 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr．Oil on superoxide anion radicals

圖8 BHT和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig．8 Scavenging effects of BHT and VC on superoxide anion radicals

3 結(jié)論

采用體外抗氧化模型，以VC和BHT為陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)冷榨藤椒油和無水乙醚提取的藤椒油的抗氧化能力。研究結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為11mg/mL的溶劑油對(duì)·OH、DPPH·、的清除率分別為84．63%、86．87%、78．26%;質(zhì)量濃度為 11mg/mL 的冷榨油對(duì)·OH、DPPH·、的清除率分別為65．98% 、50．93% 、80．93%。冷榨油和溶劑油的還原能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)·OH、DPPH·、清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，呈現(xiàn)了良好的劑量效應(yīng)關(guān)系;冷榨油對(duì)·OH、DPPH·、的 IC50值分別為 4．0675、10．3052 和0．5415mg/mL;溶劑油對(duì)·OH、DPPH·、的 IC50值分別為 1．9606、2．9465 和 1．6053mg/mL。當(dāng)溶劑油質(zhì)量濃度達(dá)到9mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率達(dá)到89．79%，其清除效果高于1mg/mL VC對(duì)·OH(清除率71．82%)清除效果;當(dāng)溶劑油質(zhì)量濃度達(dá)到11mg/mL時(shí)，對(duì) DPPH·清除率達(dá)到86．87%，遠(yuǎn)高于 1mg/mL BHT 清除率(44．51%)。

綜上所述，藤椒油具有良好的體外抗氧化能力，是一種有效的抗氧化劑。

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