復(fù)方阿膠漿納米級(jí)組分對(duì)骨髓細(xì)胞、癌細(xì)胞增殖影響的研究

李素芬，郭尚敬

(1．聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252000;2．聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252000)

目前腫瘤已成為致人死亡的第二大殺手，探究高效低毒的抗腫瘤藥物，已是世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。中藥也加入此行列，多組分中藥已盛行。復(fù)方阿膠漿是山東省東阿阿膠股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的中藥保健品，由熟地黃、人參、阿膠、黨參等中藥制成［1］。復(fù)方阿膠漿不僅可用于補(bǔ)血，在臨床應(yīng)用中還可以作為抗癌、抗腫瘤的輔助治療手段。

近幾年，研究者對(duì)復(fù)方阿膠漿的研究主要集中在臨床作用效果或者建立動(dòng)物模型方面，例如，曾屈波［2］等發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿臨床治療因放化療而致的白細(xì)胞減少的病例中，可明顯延長(zhǎng)生存期，改善病人生活質(zhì)量。何佩珊［3］等發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿具有治療或延緩腫瘤化療相關(guān)性貧血的作用，能顯著改善腫瘤化療相關(guān)性貧血患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量。趙井苓［4］等在研究中證明了復(fù)方阿膠漿可減輕化療的骨髓抑制作用。劉培民［5］等發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿對(duì)荷Lewis肺癌小鼠具有一定的抑瘤作用，較化療藥組有明顯的優(yōu)勢(shì)。聯(lián)合放療可見(jiàn)到瘤重明顯縮小，出現(xiàn)協(xié)同增效作用。劉培民［6］等還發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿對(duì)S180肉瘤具有一定的抑瘤作用，可明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，聯(lián)合化療應(yīng)用就有協(xié)同增效作用，并可減少化療所帶來(lái)的白細(xì)胞減少及免疫力低下等副作用。

由于目前很多報(bào)導(dǎo)都是以臨床患者或者建動(dòng)物模型，來(lái)研究復(fù)方阿膠漿對(duì)癌癥患者具有良好的預(yù)后效果，而對(duì)阿膠或復(fù)方阿膠漿在體外細(xì)胞株培養(yǎng)方面的報(bào)導(dǎo)少之又少。還沒(méi)發(fā)現(xiàn)對(duì)復(fù)方阿膠漿納米級(jí)組分(英文簡(jiǎn)稱CEJSNC)的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，尤其是對(duì)CEJSNC在體外培養(yǎng)細(xì)胞株方面的報(bào)導(dǎo)。為了更直觀展示復(fù)方阿膠漿的抗癌作用，本研究更關(guān)注復(fù)方阿膠漿納的微組分，創(chuàng)新性的獲得CEJSNC，它們富含多種生物活性組分，主要包含寡肽，氨基酸，微量元素，該組分具有易吸收的特點(diǎn)，進(jìn)一步從體外細(xì)胞培養(yǎng)層面，在DOX模擬化療前、后，研究CEJSNC對(duì)骨髓細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖抑制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復(fù)方阿膠漿 山東東阿阿膠股份有限公司;星昊美彤復(fù)方消化酶膠囊 北京星昊醫(yī)藥股份有限公司;注射用鹽酸阿霉素(DOX) 浙江海正藥業(yè)股份有限公司;protein Ladder Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 CEJSNC的制備 取一支20mL的復(fù)方阿膠漿轉(zhuǎn)移到50mL的離心管中，用NaOH，調(diào)pH由原來(lái)的5．12 至木瓜酶的最適 pH5．65≈5．7，加入一粒提前粉碎的木瓜酶，37℃孵育2h。用HCl調(diào)pH，由原來(lái)的5．65 至胃蛋白酶的最適 pH1．92≈2．0，加入一粒提前粉碎的胃蛋白酶，37℃孵育5h。用NaOH調(diào)pH，由原來(lái)的1．92 至胰蛋白酶的最適 pH7．92≈8．0，加入一粒提前粉碎的胰蛋白酶，37℃孵育5h。調(diào)pH與培養(yǎng)基一致為pH7．4。高速冷凍離心機(jī)在4℃下8000r/min離心10min，取上清;先用濾紙過(guò)濾，再用10K的超濾離心管3000r/min進(jìn)行超濾;在超凈工作臺(tái)中，用PALL 0．2μm一次性針頭濾器過(guò)濾分裝。

1．2．2 復(fù)方阿膠漿消化處理前、后的樣品紫外光譜測(cè)定 用250～800nm紫外吸收光譜進(jìn)行復(fù)方阿膠漿消化處理前、后的樣品的吸收波長(zhǎng)的掃描，確定了主要成分為寡肽、氨基酸。

1．2．3 SDS-PAGE 電泳 根據(jù) Laemmli［7］的方法，分別制備5%聚丙烯酰胺濃縮膠和12%聚丙烯酰胺分離膠，用SDS-PAGE電泳鑒定其消化前后的組分降解效果。

1．2．4 ALV-DLS 表征CEJSNC分子的大小。

1．2．5 骨髓造血干細(xì)胞的獲取 取一只健康的小鼠，通過(guò)脫臼處死，浸泡在75%乙醇中，2min后置于超凈臺(tái)中，取出小鼠，腹面朝上用針頭固定四肢，用手術(shù)剪，剪開(kāi)后肢一側(cè)的皮膚，去掉股骨上的肉，置于PBS中，再取另外一根股骨;準(zhǔn)備培養(yǎng)基，用5mL的注射器(0．33mm的針頭)，用手術(shù)剪在股骨關(guān)節(jié)處略微剪一下，不能把其完全剪掉，用吸有5mL的培養(yǎng)基的注射器對(duì)其骨髓內(nèi)部沖洗，并收集于15mL離心管中，離心，再加適量培養(yǎng)基重懸(取部分進(jìn)行培養(yǎng))、計(jì)數(shù)、鋪板。

1．2．5．1 CEJSNC和DOX對(duì)骨髓細(xì)胞處理 通過(guò)計(jì)數(shù)并稀釋至1×106/mL，接種于96孔板，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜后，按梯度加CEJSNC(終濃度按體積百分比):1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。按梯度加 DOX(μg/mL):1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，各三個(gè)重復(fù)。孵育24h 后，每孔加10uL 的CCK-8并孵育2h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況。并確定最佳阿霉素濃度為4μg/mL。

他怎么可以說(shuō)我是個(gè)沒(méi)媽的孩子？我又怎么可能沒(méi)有媽呢？如果沒(méi)有媽，我是古意從哪里弄來(lái)的？而且從六歲的時(shí)候，我就已經(jīng)知道了康美娜的存在。

1．2．5．2 CEJSNC 和 DOX 聯(lián)合時(shí)對(duì)骨髓細(xì)胞的影響取對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞鋪96孔板，密度1×106/mL，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜后，按梯度加復(fù)合組分，設(shè)立空白對(duì)照，4μg/mL DOX對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為4μg/mL DOX+2%微組分、4μg/mL DOX+4%微組分、4μg/mL DOX+8%微組分，各三個(gè)重復(fù)。孵育24h后，每孔加10μL的CCK-8并孵育2h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況。

1．2．6 細(xì)胞培養(yǎng) 參照劉文哲［8］等人介紹的方法復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞(N87)、胃癌細(xì)胞(MCF-7)和白血病細(xì)胞(Raji)分別接種于 50mL培養(yǎng)瓶，加入RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清和青、鏈霉素各100U/mL)8mL，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。每2～3d更換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞長(zhǎng)至2～5d左右，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿貼壁細(xì)胞，即可傳代。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用吸管吸去舊培養(yǎng)液，換用新的無(wú)菌吸管吸取0．25%胰蛋白酶液2mL以剛沒(méi)過(guò)細(xì)胞層為度，進(jìn)行消化，靜置約2～5min，并不時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞界限模糊不清時(shí)取新吸管小心吸棄胰蛋白酶液，加入2～3mL PBS液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，小心吸取PBS液，加入完全培養(yǎng)液，用吸管取培養(yǎng)液輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使其脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，取實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)分瓶，并置于含5%CO2的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。每5～7d傳代一次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1．2．6．1 用CEJSNC 和DOX 對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌、胃癌和白血病細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N87、MCF-7、Raji 三種癌細(xì)胞，加入0．25%胰蛋白酶液消化，用PBS液洗滌2次，離心后吸棄上清液，用4mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋分別以1×104/孔、1×104/孔和1×105/孔接種于96孔板。待細(xì)胞豐度達(dá)到70%～80%時(shí)，按梯度加CEJSNC(終濃度按體積百分比):1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，并設(shè)立空白對(duì)照;按梯度加DOX(μg/mL):1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 各三個(gè)重復(fù)。待 24h 后，去舊培養(yǎng)基，加10%的CCK-8培養(yǎng)基孵育2h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。以確定作用三種細(xì)胞的最佳濃度分別是多少。

1．2．6．2 CEJSNC 和 DOX 聯(lián)合時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌、胃癌和白血病細(xì)胞的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N87、MCF-7、Raji三種癌細(xì)胞，加入 0．25% 胰蛋白酶液消化，用PBS液洗滌2次，離心后吸棄上清液，用4mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋分別以1×104/孔、1×104/孔和1×105/孔接種于96孔板。待細(xì)胞豐度達(dá)到70%～80%時(shí)，MCF-7、Raji細(xì)胞的處理如下:設(shè)立空白對(duì)照，6μg/mLDOX對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為6μg/mL DOX+2%CEJSNC、6μg/mLDOX+4%CEJSNC、6μg/mL DOX+8%CEJSNC，各三個(gè)重復(fù);N87細(xì)胞的處理如下:設(shè)立空白對(duì)照，8μg/mL DOX對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為 8μg/mL DOX+2%CEJSNC、8μg/mL DOX+4%CEJSNC、8μg/mL DOX+8%CEJSNC，各三個(gè)重復(fù)。孵育24h后，每孔加10μL的CCK-8并孵育2h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況。

1．2．7 數(shù)據(jù)處理 用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件、Excel等統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性處理，利用制圖origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)紫外掃描分光光度級(jí)對(duì)復(fù)方阿膠漿消化處理前后的樣品進(jìn)行吸收波長(zhǎng)的掃描，以確定復(fù)方阿膠漿原漿(CEJS)和復(fù)方阿膠漿納米組分(CEJSNC)的主要組分

寡肽、氨基酸在260～280nm處有最大吸收波長(zhǎng)。復(fù)方阿膠漿消化處理前后的樣品在270nm左右處都有最強(qiáng)吸收峰，見(jiàn)(圖1、圖2)，進(jìn)一步確認(rèn)復(fù)方阿膠漿原漿和經(jīng)消化降解后的主要成分為寡肽、氨基酸。

圖1 CEJS的紫外-可見(jiàn)掃描結(jié)果Fig．1 Ultraviolet absorotion soectroscodV of CEJSNC

2.2 通過(guò)蛋白質(zhì)電泳技術(shù)來(lái)觀察其消化前后的組分降解效果

圖2 CEJSNC的紫外-可見(jiàn)掃描結(jié)果Fig．2 Ultraviolet absorotion soectroscodV of CEJSNC

如(圖2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方阿膠漿中大分子蛋白質(zhì)通過(guò)模擬消化系統(tǒng)已充分分解為小分子多肽或氨基酸。再通過(guò)12%的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)樣品處理前后組分的變化情況，表明通過(guò)處理后獲得了大量的小于10ku的組分;Thermo公司protein Ladder大小(ku)依次為:170、130、100、70、55、40、35、25、15、10。

圖3表明復(fù)方阿膠漿原液(CEJS)由不同分子量大小的蛋白、寡肽、氨基酸組成，在150ku最集中，10ku以下很少;由圖4可見(jiàn)條帶主要集中于10ku，說(shuō)明復(fù)方阿膠漿中大分子蛋白質(zhì)通過(guò)模擬消化系統(tǒng)已充分分解為小分子多肽或氨基酸。

圖3 CEJS 12%SDS-PAGE電泳圖Fig．3 12%SDS-PAGE of compound glue mucilage protoplasm

圖4 CEJSNC 12%SDS-PAGE電泳圖Fig．4 SDS-PAGE of compound glue mucilage micro components

2.3 通過(guò)ALV-DLS表征CEJSNC 的顆粒度大小

利用ALV-DLS光散射儀檢測(cè)復(fù)方阿膠漿消化處理前后其組分分子顆粒度的變化，結(jié)果表明，CEJS經(jīng)消化處理后，得到了直徑為4nm的微小組分，而處理前直徑約1μm，所以CEJSNC更易被細(xì)胞直接吸收，見(jiàn)(圖 5)。

圖5 CEJS、CEJSNC的顆粒度檢測(cè)圖譜Fig．5 Particle size detection map of CEJS and CEJSNC

2.4 通過(guò)用CEJSNC對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探究了CEJSNC對(duì)造血功能產(chǎn)生的影響

圖6顯示在DOX濃度為4μg/mL時(shí)對(duì)骨髓細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng);圖7表明隨著CEJSNC使用濃度的增加，其對(duì)骨髓細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用也越顯著;在與阿霉素聯(lián)合使用時(shí)，與單獨(dú)使用DOX的對(duì)照組對(duì)比，CEJSNC都能顯著促進(jìn)對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞的增殖(p＜0．01)，甚至在高濃度下比空白組的骨髓細(xì)胞都生長(zhǎng)良好(見(jiàn)圖8)。所以 CEJSNC具有保護(hù)骨髓造血系統(tǒng)的功能，對(duì)貧血、失血、血?dú)獠蛔愕娜司哂辛己玫寞熜А?/p>

圖6 不同濃度DOX對(duì)骨髓細(xì)胞增殖抑制的影響Fig．6 Different concentration of DOX make an effect on the proliferation inhibition of bone marrow cells

2.5 通過(guò)乳腺癌、胃癌和白血病細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探究了CEJSNC的抗腫瘤作用

結(jié)果表明:CEJSNC對(duì)癌細(xì)胞有一定抑制作用，尤其是乳腺癌細(xì)胞MCF-7效果顯著性(p＜0．01)，如圖10所示;在高濃度下對(duì)胃癌細(xì)胞抑制有顯著性(p＜0．01)，如圖9所示;而高濃度的 CEJSNC對(duì)Raji細(xì)胞有輕微增殖促進(jìn)作用，但不顯著(p＞0．05)，如圖11所示。

2.6 通過(guò)化療藥物鹽酸阿霉素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)，尋找鹽酸阿霉素對(duì)三種癌細(xì)胞的最佳作用濃度。圖12顯示:DOX在濃度為8μg/mL時(shí)，胃癌N87細(xì)胞存活率最低，而對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和白血病Raji細(xì)胞在濃度為5～7μg/mL時(shí)，其存活率最低。以此為最佳濃度。

圖7 不同濃度CEJSNC對(duì)骨髓細(xì)胞的影響Fig．7 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of bone marrow cells．

圖8 三種不同CEJSNC與DOX聯(lián)合對(duì)骨髓細(xì)胞的影響Fig．8 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on bone marrow cell

圖9 不同濃度的CEJSNC對(duì)N87細(xì)胞增殖抑制的影響Fig．9 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of N87 cells

2.7 利用DOX模擬化療環(huán)境，研究CEJSNC對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用

結(jié)果:結(jié)合圖13、圖14，在與單獨(dú)使用阿霉素對(duì)照組相比(右半部分)，發(fā)現(xiàn)中低濃度的CEJSNC對(duì)癌細(xì)胞的增殖沒(méi)有抑制作用，而高濃度的情況下出現(xiàn)了兩個(gè)截然相反的結(jié)果-N87受抑制/MCF-7促進(jìn)，但與空白組相比扔具有極顯著的抑制作用(p＜0．01);結(jié)合圖15，與單獨(dú)使用阿霉素對(duì)照組相比，高濃度條件下會(huì)降低白血病化療的效果，這可能是由于白血病細(xì)胞也是來(lái)自骨髓，也具有利用CEJSNC的能力，而促進(jìn)其增殖。所以不是任何癌癥化療后的病人食用越多越好，胃癌可以中高劑量食用，乳腺癌可以中小劑量食用，而白血病患者只能小劑量食用，這樣可兼具治療和良好的預(yù)后。

圖10 不同濃度的CEJSNC對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制的影響Fig．10 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of MCF-7cells

圖11 不同濃度的CEJSNC對(duì)Raji細(xì)胞增殖抑制的影響Fig．11 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of Raji cells

圖12 不同濃度的DOX對(duì)N87、MCF-7、Raji三種癌細(xì)胞的增殖抑制作用Fig．12 Different concentration of DOX make an effect on the proliferation inhibition of cancer cells(N87、MCF-7、Raji)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)模擬消化系統(tǒng)對(duì)復(fù)方阿膠漿做了一系列的處理，獲得了易吸收的納米級(jí)微小組分CEJSNC，該組分主要成分是寡肽和氨基酸(也有多肽)，有關(guān)研究表明寡肽具有抗癌作用［10］。CEJSNC對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞的增殖促進(jìn)與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞計(jì)數(shù)有顯著性差異(p＜0．01)，與DOX聯(lián)合使用時(shí)與單用阿霉素處理的對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0．01)。復(fù)方阿膠漿納米級(jí)微組分對(duì)三種癌細(xì)胞具有一定的增殖抑制效果(乳腺癌更明顯)，所以正常人經(jīng)常食用可降低癌癥的發(fā)生率;然而經(jīng)與阿霉素聯(lián)合使用時(shí)，高濃度的復(fù)方阿膠漿納米級(jí)微組分會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖而抑制胃癌的增殖，與空白組相比仍然具有顯著的增殖抑制作用(p＜0．01);由于白血病細(xì)胞是骨髓中白細(xì)胞的變異細(xì)胞，所以在化療后CEJSNC也能顯著促進(jìn)其增殖(p＜0．01)，所以白血病患者應(yīng)減少食用的量，以兼具治療和良好的預(yù)后。

圖13 三種不同濃度的CEJSNC與DOX聯(lián)合對(duì)N87細(xì)胞的影響Fig．13 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

圖14 三種不同CEJSNC與DOX聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響Fig．14 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

圖15 三種不同濃度CEJSNC與DOX聯(lián)合對(duì)Raji細(xì)胞的影響Fig．15 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

通過(guò)對(duì)CEJSNC的研究，以及探究CEJSNC對(duì)骨髓細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖抑制作用，為阿膠是否能作為生活保健品提供了參考;CEJSNC可直接被細(xì)胞吸收，進(jìn)一步為阿膠的中藥注射劑提供了可行性依據(jù);為今后從分子機(jī)制方面探究阿膠納米級(jí)組分對(duì)不同細(xì)胞的影響提供借鑒。為阿膠抗癌保健品的研制和阿膠抗腫瘤藥物的研制提供參考。相信隨著對(duì)復(fù)方阿膠漿研究的不斷深入，復(fù)方阿膠漿更多的作用機(jī)制將得以闡述。

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