希金斯炭疽菌腺苷酸環(huán)化酶生物信息學分析

韓長志

摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等眾多十字花科蔬菜引起炭疽病，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。通過對該菌中可能的腺苷酸環(huán)化酶（AC）氨基酸序列進行理化性質、細胞信號肽、跨膜區(qū)結構以及二級結構等生物信息學分析。結果表明，該菌種ChCap1，ChCap2與Srv2在理化性質、二級結構、亞細胞定位方面差異較大，以期為深入開展AC基因的定位、表達以及功能域等方面研究及為進一步實現(xiàn)以控制病原菌G蛋白信號途徑功能新藥物靶標的開發(fā)提供有力的理論支撐。

關鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）;腺苷酸環(huán)化酶;理化性質;亞細胞定位;二級結構

中圖分類號：S763 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4992-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.061

Bioinformatics Analyses of Adenylate Cyclase of Colletotrichum higginsianum

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control

of Yunnan Province， Kunming ?650224， China）

Abstract：Colletotrichum higginsianum can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， causing huge economic losses to the production. Based on our previous research， bioinformatics analyses of the typical adenylate cyclase （AC） sequence including the physicochemical properties， signal peptide， trans-membrane domain structure and the secondary structure were made. The results showed that there were differences in physicochemical properties， secondary structure，subcellular locatization between chCap1，chCap2 and Srv2. It will provide theoretical basis for developing new drug targets to control pathogen cell division and gene mapping of AC gene.

Key words：Colletotrichum higginsanum;adenylate cyclase;physicochemical properties;subcellular localization;secondary structure

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、小油菜、大白菜、蘿卜、結球甘藍、羽衣甘藍等十字花科蔬菜植物而引起炭疽病，是一類重要的世界性植物真菌病害[1-3]。目前，由該菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心最常見的嚴重病害之一[4]。該病對廣東菜心種植地區(qū)產(chǎn)生重大影響，不僅降低了菜心產(chǎn)量，也影響著菜心品質[5，6]。生產(chǎn)上對炭疽病的防治多采用多菌靈、甲基托布津、苯菌靈等苯并咪唑類化學藥劑，而由于該類藥劑作用靶標以及作用時間的特殊性容易引起炭疽菌產(chǎn)生抗藥性，嚴重地制約著上述藥劑的進一步使用。同時，與禾谷炭疽菌同屬炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）對多菌靈的抗藥性受到廣泛關注[7-12]，而生產(chǎn)上尚未有新的有效藥劑用于炭疽病的防治。

植物與病原菌互作過程中，許多細胞信號轉導途徑共同作用從而完成對外界環(huán)境刺激、內(nèi)部信號傳遞以及應對反應處置等。其中，尤以將外界信號傳遞到細胞內(nèi)部的G蛋白（鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，Guanine nucleotide binding protein）信號途徑所發(fā)揮的作用最大。腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase， AC）作為G蛋白信號通路調(diào)節(jié)的重要因子發(fā)揮重要作用，其功能主要是將cAMP轉化為5-AMP，從而完成信號的終止過程。通過對該酶功能的深入解析，有助于為今后開發(fā)以此為藥劑靶標的化學農(nóng)藥提供重要的理論指導。目前，對于希金斯炭疽菌的AC研究卻鮮有報道，前期通過對釀酒酵母（S. cerevisiae）S288c含有的1個典型AC（Srv2）氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質數(shù)據(jù)庫進行Blast比對及關鍵詞搜索[13];同時，通過SMART保守結構域分、理化性質、細胞信號肽、跨膜區(qū)結構以及二級結構等生物信息學分析，明確與Srv2同源的希金斯炭疽菌AC相關蛋白ChCap1、ChCap2分別位于AC的C端和N端。

本研究基于前期研究，通過保守結構域分析、疏水性分析、二級結構預測、信號肽分析以及跨膜區(qū)結構分析、亞細胞定位等生物信息學分析，以期明確該菌AC理化性質、結構特征以及定位情況，同時，對其進行同源序列之前的遺傳關系分析，以期為進一步開展同屬于炭疽菌屬但其基因組序列尚未公布的其他炭疽菌研究提供重要的理論指導。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

根據(jù)前期遺傳關系分析，禾谷炭疽菌與希金斯炭疽菌在AC同源序列方面存在較近的關系，由于ChCap1、ChCap2分別位于AC的C端和N端，對上述合并序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其理化性質、亞細胞定位以及二級結構特性與Srv2有較大的差異，因此選擇禾谷炭疽菌的AC序列中的中間序列作為希金斯炭疽菌的中間序列，從而開展后續(xù)生物信息學分析（表1）。

1.2 ?生物信息學分析

1.2.1 ?保守結構域預測 ?利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線分析希金斯炭疽菌中AC蛋白序列所具有的保守結構域特征。

1.2.2 ?蛋白質理化性質預測 ?利用蛋白質數(shù)據(jù)庫（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線進行分析預測AC相關蛋白序列的等電點、分子質量及氨基酸組成等特征。

1.2.3 ?蛋白質疏水性預測 ?利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）對希金斯炭疽菌中AC相關蛋白序列進行疏水性測定。

1.2.4 ?蛋白質轉運肽及信號肽預測 ?對蛋白質轉運肽（transit peptide）的預測利用TargetP 1.1 Server在線分析實現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[14]。氨基酸信號肽（Signal peptide）的預測則是利用SignalP 3.0 Server[15]在線分析實現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）。在線預測信號肽使用神經(jīng)網(wǎng)絡方法（Neural networks， NN）和隱馬可夫模型（Hidden markov models， HMM）進行操作，而根據(jù)算法不同得出的結果有所差別。

1.2.5 ?蛋白質二級結構及跨膜區(qū)結構預測 ?對蛋白質二級結構預測采用PHD[16]在線分析實現(xiàn)（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）。同時，對希金斯炭疽菌中AC相關蛋白序列的跨膜區(qū)結構預測，利用TMHMM Server v. 2.0實現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）[15]。

1.2.6 ?亞細胞定位分析 ?對希金斯炭疽菌中AC相關蛋白序列進行亞細胞定位分析，利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）實現(xiàn)[17]，以期獲得蛋白質的定位情況。

2 結果與分析

2.1 ?保守結構域預測結果

基于SMART分析網(wǎng)站，對ChCap1、ChCap2合并序列進行保守結構域分析。結果表明，Srv2在C端含有兩個相同的CARP保守結構域，合并序列也含有兩個CARP保守結構域，將其初步命名為腺苷酸環(huán)化酶蛋白（Adenylate cyclase protein），ChSrv2（圖1）。

2.2 ?ChSrv2與Srv2氨基酸組成分析結果

根據(jù)組成蛋白質的氨基酸殘基的理化性質，將其分為酸性氨基酸、堿性氨基酸、非極性R基氨基酸、不帶電荷的極性R基氨基酸等四大類。對ChSrv2與Srv2中氨基酸殘基組成進行對比分析。結果表明，ChSrv2與Srv2的氨基酸數(shù)量以及所占比例、所含最高（最低）比例氨基酸及其所占比例方面均具有較大的一致性（表2）。Srv2所含最高比例的氨基酸為絲氨酸（Ser），比例為11.00%，而ChSrv2含最高比例的氨基酸也為Ser，比例為9.60%;在所含最低比例的氨基酸方面，Srv2為半胱氨酸（Cys），比例為0.80%，ChSrv2也為Cys，最低比例為0.40%（表2）。

2.3 ?Srv2與ChSrv2理化性質分析結果

Srv2與ChSrv2在氨基酸數(shù)量、相對分子質量、理論等電點、負電荷氨基酸殘基數(shù)、正電荷氨基酸殘基數(shù)、分子式以及原子數(shù)量、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等方面均存在著較大的一致性，特別是在理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)，ChCap2與Srv2相似，理論等電點屬于酸性范圍內(nèi)，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白;ChCap1與Srv2則具有較大的差異，其理論等電點屬于偏堿性范圍，其不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白（表3）。

2.4 ?轉運肽和信號肽特征

轉運肽是一種由12～60個氨基酸殘基所組成的前導序列，其功能為引導那些在細胞溶質中合成的蛋白質進入線粒體和葉綠體等細胞器。除了細胞信號蛋白外各種內(nèi)在蛋白均利用導肽到達細胞器。通過分析，Srv2與ChCap1、ChCap2均定位于分泌途徑上，其預測值分別為0.883、0.701、0.660，所處的概率有所不同（表4）。就信號肽預測而言，無論是根據(jù)NN進行計算，還是根據(jù)HMM進行計算，Srv2與ChCap1、ChCap2均不含有信號肽。

2.5 ?蛋白疏水性預測結果

根據(jù)Protscale分析可知，ChCap1位于36位的絲氨酸（S），其親水性最強，為-1.926，而位于129位的脯氨酸（P），其疏水性最強（親水性最弱，下同），為1.626;ChCap2位于54位的蘇氨酸（T），其親水性最強，為-1.005，而位于174位的丙氨酸（A），其疏水性最強，為1.626。Srv2在親水性（疏水性）最強的氨基酸及其所在位置方面均存在著較大的不同（圖2）。endprint

對Srv2與ChCap1、ChCap2的疏水性、親水性數(shù)值進行統(tǒng)計分析。結果表明，3種蛋白在親水性最強氨基酸殘基位置、數(shù)值，疏水性最強氨基酸殘基位置、數(shù)值，疏水性氨基酸殘基數(shù)值總和以及親水性氨基酸殘基數(shù)值總和等方面均存在著較大差異，惟一的相同點是均為親水性蛋白，這與通過GRAVY計算所得結果一致。

2.6 ?亞細胞定位特征

通過分析表明，希金斯炭疽菌ChSrv2亞細胞定位與Srv2相同，均定位于質膜上，這與前人對腺苷酸環(huán)化酶定位于細胞膜上的研究相一致。

2.7 ?Srv2在二級結構特征方面與ChCap1、ChCap2存在較大差異

通過分析表明，與Srv2相同，ChCap1、ChCap2均沒有典型的跨膜結構。對其二級結構進行分析表明，在二級結構組成方面，ChCap1、ChCap2與Srv2存在著較大差異（圖3）。

3 ?小結與討論

作為炭疽菌屬中重要的病原菌，希金斯炭疽菌主要危害十字花科蔬菜，造成重要的經(jīng)濟損失，國內(nèi)外學者對其開展了全面而深入的研究。然而，生產(chǎn)上對其引起的炭疽病多采用苯并咪唑類化學藥劑防治，而由于該藥劑作用靶標以及作用時間的特殊性，均容易引起炭疽菌抗藥性出現(xiàn)，嚴重地制約著上述藥劑的進一步使用，急需開發(fā)用于防治炭疽病的新作用機制化學藥劑，從而較好地挽回生產(chǎn)上的經(jīng)濟損失。

近年來，關于AC在酵母[18]、稻瘟菌[19]、大豆疫霉[20]等真核生物中的功能研究已積累了較多的試驗數(shù)據(jù)，而對于危害禾本科植物造成嚴重損失的禾谷炭疽菌的AC研究卻鮮有報道，隨著該病菌全基因組序列的公布，國內(nèi)外學者對其開展致病基因、抗藥性基因的研究將日趨深入。本研究基于釀酒酵母中已經(jīng)報道的Srv2，利用Blast比對、關鍵詞搜索以及通過SMART保守結構域分析、細胞信號肽、跨膜區(qū)結構以及二級結構等生物信息學分析，明確該菌中ChCap1、ChCap2與Srv2在理化性質、二級結構、亞細胞定位方面均具有較大的差異性，同時，通過對上述兩個腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白與其他物種中的同源序列進行Blast比對分析，明確ChCap1、ChCap2分別是希金斯炭疽菌腺苷酸環(huán)化酶蛋白序列的重要組成部分，其分別位于N端和C端。通過對其進行序列合并，并結合其SMART保守結構域分析、理化性質、細胞信號肽、跨膜區(qū)結構以及二級結構、亞細胞定位等生物信息學分析，結果表明合并后的序列在上述特征、性質方面與Srv2具有較大的相似性。該研究為進一步解析希金斯炭疽菌腺苷酸環(huán)化酶的序列以及功能研究提供重要的理論指導。

參考文獻：

[1] 沈瑞清，張 ?萍，郭成瑾，等.寧夏炭疽菌屬真菌資源研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2012，41（5）：100-102，149.

[2] 梁惠凌，唐 ?輝.廣西常見花卉真菌性病害的防治[J].廣西園藝， 2002（2）：18-19.

[3] HYDE K， CAI L， CANNON P， et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 147-182.

[4] 盧博彬，楊 ?暹.菜心炭疽病研究進展[J].長江蔬菜，2009（24）： 1-5.

[5] 張 ?華，周而勛，劉自珠，等.菜心炭疽病苗期抗病性鑒定技術[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，1998，19（3）：50-53.

[6] 張 ?華，劉自珠，鄭巖松，等.菜心品種資源炭疽病抗性鑒定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2000（3）：47-49.

[7] 李 ?洋，劉長遠，陳秀蓉，等.遼寧省葡萄炭疽菌鑒定及對多菌靈敏感性研究[J].植物保護，2009（4）：74-77.

[8] 韓國興，禮 ?茜，孫飛洲，等.杭州地區(qū)草莓炭疽病病原鑒定及其對多菌靈和乙霉威的抗藥性[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2009（6）： 1169-1172.

[9] 徐大高，潘汝謙，鄭 ?仲，等.芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性監(jiān)測[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2004，32（1）：34-36.

[10] 楊 ?葉，何書海，張淑娟，等.海南芒果炭疽菌對多菌靈的抗藥性測定[J].熱帶作物學報，2008，29（1）：73-77.

[11] 詹儒林，李 ?偉，鄭服叢.芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性[J]. 植物保護學報，2005，32（1）：71-76.

[12] 張令宏，李 ?敏，高兆銀，等.抗多菌靈的芒果炭疽病菌的殺菌劑篩選及其交互抗性測定[J].熱帶作物學報，2009，30（3）： 347-352.

[13] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： A new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）： 3389-3402.

[14] EMANUELSSON O， BRUNAK S， VON H G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 953-971.

[15] BENDTSEN J D， NIELSEN H， VON H G， et al. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）： 783-795.

[16] KELLEY L A， STERNBERG M J. Protein structure prediction on the Web： A case study using the Phyre server[J]. Nature Protocals， 2009， 4（3）： 363-371.

[17] EMANUELSSON O， NIELSEN H， BRUNAK S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（4）： 1005-1016.

[18] GERST J E， FERGUSON K， VOJTEK A， et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Molecular and Cellular Biology， 1991， 11（3）： 1248-1257.

[19] 張海峰.稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關基因的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[20] 華辰雷.大豆疫霉G蛋白和鈣信號途徑的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.endprint

[14] EMANUELSSON O， BRUNAK S， VON H G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 953-971.

[15] BENDTSEN J D， NIELSEN H， VON H G， et al. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）： 783-795.

[16] KELLEY L A， STERNBERG M J. Protein structure prediction on the Web： A case study using the Phyre server[J]. Nature Protocals， 2009， 4（3）： 363-371.

[17] EMANUELSSON O， NIELSEN H， BRUNAK S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（4）： 1005-1016.

[18] GERST J E， FERGUSON K， VOJTEK A， et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Molecular and Cellular Biology， 1991， 11（3）： 1248-1257.

[19] 張海峰.稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關基因的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[20] 華辰雷.大豆疫霉G蛋白和鈣信號途徑的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.endprint

[14] EMANUELSSON O， BRUNAK S， VON H G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 953-971.

[15] BENDTSEN J D， NIELSEN H， VON H G， et al. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）： 783-795.

[16] KELLEY L A， STERNBERG M J. Protein structure prediction on the Web： A case study using the Phyre server[J]. Nature Protocals， 2009， 4（3）： 363-371.

[17] EMANUELSSON O， NIELSEN H， BRUNAK S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（4）： 1005-1016.

[18] GERST J E， FERGUSON K， VOJTEK A， et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Molecular and Cellular Biology， 1991， 11（3）： 1248-1257.

[19] 張海峰.稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關基因的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[20] 華辰雷.大豆疫霉G蛋白和鈣信號途徑的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.endprint

[14] EMANUELSSON O， BRUNAK S， VON H G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 953-971.

[15] BENDTSEN J D， NIELSEN H， VON H G， et al. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）： 783-795.

[16] KELLEY L A， STERNBERG M J. Protein structure prediction on the Web： A case study using the Phyre server[J]. Nature Protocals， 2009， 4（3）： 363-371.

[17] EMANUELSSON O， NIELSEN H， BRUNAK S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（4）： 1005-1016.

[18] GERST J E， FERGUSON K， VOJTEK A， et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Molecular and Cellular Biology， 1991， 11（3）： 1248-1257.

[19] 張海峰.稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關基因的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[20] 華辰雷.大豆疫霉G蛋白和鈣信號途徑的功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.endprint