纖維素酶法提取山藥多糖的工藝優(yōu)化

喬宇+游江+汪蘭+吳文錦+丁安子+高虹+史德芳+陳學玲+王俊+程薇+廖李

摘要：利用響應面法優(yōu)化了纖維素酶法提取山藥（Dioscorea opposita Thunb）多糖的工藝條件。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對提取時間、提取溫度、pH 3個因素進行優(yōu)化，建立了山藥多糖提取率的二次回歸方程，通過響應面分析及嶺嵴分析得到最優(yōu)提取工藝為料液比1∶20（m/V，g∶mL），加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃、提取時間163.5 min，pH ?4.09，該條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

關鍵詞：山藥（Dioscorea opposita Thunb）多糖;提取;纖維素酶;響應面法

中圖分類號：Q556 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4926-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.041

Optimization of Extracting Polysaccharide from Chinese Yam Root Using Cellulase

QIAO Yu，YOU Jiang，WANG Lan，WU Wen-jin，DING An-zi，GAO Hong，SHI De-fang，CHEN Xue-ling，

WANG Jun，CHENG Wei，LIAO Li

（Agricultural Products Processing Subcenter of Hubei Agricultural Science Technology Innovation Center / Research Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： The conditions of extracting polysaccharide from Chinese yam root was optimized by response surface analysis. According to the single-factor experiments， three levels of the factors including extraction temperature， extraction time and pH value were selected to establish a quadric regression equation for describing the yield of polysaccharide from Chinese yam root. Through response surface analysis， the optimal conditions were the liquid to solid ratio of 1∶20， the enzyme concentration of 12 U/g，extraction temperature of 42 ℃，time of 163.5 min and pH of 4.09. The estimated value and verified value of polysaccharide was 6.082% under the optimal conditions.

Key words： polysaccharide from Chinese Yam Root;extraction;cellulase;response surface methodology

山藥（Dioscorea opposita Thunb）是薯蕷類植物的根莖，具有補中益氣、消渴生津、保健養(yǎng)顏、滋腎益精、益肺止咳等功效[1]，其脂肪含量極低，富含多酚氧化酶、皂甙、黃酮、游離氨基酸、蛋白質、多種微量元素等[2]。多糖是山藥的主要活性成分之一，有一定的抗氧化活性和降血糖作用，能刺激和調節(jié)人體的免疫功能，增強白細胞的吞噬功能[3]。目前多糖的提取方法主要有水提法[4]、酶解法[5]、微波和超聲波[6]等輔助提取法、膜分離和超臨界萃取等方法。纖維素酶法已經越來越多的用于植物多糖的提取，纖維素酶能破壞植物細胞壁的致密結構，加速多糖的溶出，從而提高提取率[7]。本試驗在水浸提法的基礎上采用纖維素酶法來提高山藥多糖的提取率，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對提取時間、提取溫度、pH 3個因素進行優(yōu)化，旨在建立纖維素酶法提取山藥多糖的最優(yōu)工藝，為山藥多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

山藥粉（200目）：湖北省利川市匯川現代農業(yè)有限公司提供;纖維素酶：酶活10 000 U/g，日本ONOZUKA公司;濃硫酸、苯酚、無水乙醇、標準葡萄糖等均為分析純試劑。

試驗儀器：LXJ-ⅡB型離心機（上海安亭科學儀器廠）;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋（武漢科爾儀器設備有限公司）;3802型紫外可見分光光度計（尤尼克儀器有限公司）;PL2001型分析天平（Sartorius科學儀器有限公司）;RE40型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮升華儀器廠）;PB-10型pH計（Sartorius科學儀器有限公司）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?山藥多糖的提取 ?準確稱取山藥粉5 g，添加一定量的纖維素酶，加入100 mL的去離子水并調節(jié)pH，在設定溫度的水浴鍋中提取一定的時間后，提取液在 4 500 r/min條件下離心20 min，上清液濃縮后加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃的冰箱中過夜后離心，沉淀即為山藥多糖。

1.2.2 ?標準曲線的制作 ?準確稱取105 ℃下烘干至恒重的標準葡萄糖1 g，溶解后定容至1 L，分別取上述標準葡萄糖液1、2、3、4、5、6 mL于100 mL容量瓶中定容。取上述溶液各1 mL于比色管中，加1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻后靜置20 min，于490 nm波長下測吸光度[8]。以葡糖糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，建立測定多糖含量的回歸方程y=10 388x-0.018 4，R2 =0.998 7。

1.2.3 ?多糖含量的測定 ?取1 mL多糖提取液、1 mL 6%苯酚、5 mL濃硫酸搖勻后靜置20 min，490 nm波長下測定吸光度，根據標準曲線計算多糖含量。

1.2.4 ?多糖提取率的計算 ?提取率=M1/M2×100%。式中：M1為提取物中多糖質量;M2為山藥粉質量。

2 ?結果與分析

2.1 ?單因素試驗結果

2.1.1 ?提取溫度對多糖提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20（m/V，g∶mL，下同），pH 4.5，提取溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，提取120 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察提取溫度對多糖提取率的影響（圖1）。由圖1 可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率上升，但當溫度高于40 ℃時，提取率反而下降，因為溫度對纖維素酶的結構會產生影響，溫度過高會使酶活性下降造成提取率下降。

2.1.2 ?提取時間對多糖提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20，pH 4.5， 40 ℃分別提取60、90、120、150、180 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察提取時間對多糖提取率的影響（圖2）。由圖2可知，隨著提取時間的延長，山藥多糖提取率也隨之增加，當提取時間為150 min時，提取率基本達到平衡，之后延長提取時間不能顯著提高多糖提取率。

2.1.3 ?pH對提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20，pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察pH對多糖提取率的影響（圖3）。由圖3可知，隨著pH的升高，多糖的提取率逐漸增高，在pH為4.5時提取率達到最大，但隨著pH繼續(xù)升高，提取率反而下降，這與酶的活性有關。pH的改變會影響酶分子與底物的結合與催化，只有在特定的pH下，酶的活性才能達到最佳，從而使提取率達到最大值。

2.1.4 ?加酶量對提取率的影響 ?在加酶量分別為3、6、9、12、15 U/g，料液比1∶20，pH 4.5， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察加酶量對多糖提取率的影響（圖4）。由圖4可知，隨著加酶量的增加，提取率也隨之增加，加酶量為12 U/g時提取率最高，當加酶量繼續(xù)增大，提取率反而下降，可能的原因是在加酶量較低時酶可以和底物充分接觸，所以隨著酶量的增加提取率逐漸上升直到最高，但當酶量增加至較高時，底物不能滿足酶的要求，酶的活性被抑制，提取率反而下降。

2.1.5 ?料液比對提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，pH為4.5， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察料液比對多糖提取率的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著料液比的降低，提取率逐漸增加，料液比為1∶20時提取率最大，之后隨著料液比的繼續(xù)降低，提取率基本不變。

2.2 ?響應面法試驗結果

2.2.1 ?響應面試驗設計及其響應值分析 ?根據以上單因素的試驗結果，在加酶量為12 U/g、料液比為1∶20、沉淀時乙醇與提取液體積比為4∶1的條件下選取提取溫度、pH、提取時間3因素，因素與水平見表1，Box-Benhnken響應面試驗設計結果見表2。以多糖提取率為Y值，通過SAS軟件的RSREG程序對試驗數據進行響應面回歸分析（RSA），并作出響應面圖和等高線圖，經回歸擬合后求得回歸方程為：

Y=6.100+0.040 0X1-0.013 7X2+0.538 7X3-0.371 2X12-0.190 0X1X2-0.023 7X22+0.255 0X1X3-0.077 5X2X3-0.723 7X32

Box-Benhnken響應面方差分析見表3，模型的F=11.14，P<0.01，說明Box-Benhnken回歸模型高度顯著，一次項、二次項和總回歸都達到了極顯著水平，說明方程擬合得很好，因此可用該二次回歸方程代替試驗真實點對試驗的結果進行分析。

2.2.2 ?Box-Benhnken響應面圖 ?回歸模型的響應面見圖6、圖7和圖8。從圖6可得出多糖提取率隨提取溫度的升高而增加，在提取溫度為40 ℃時提取率最大，隨后隨溫度的升高提取率下降;多糖提取率隨提取時間的增加而增大，在提取時間為150 min時提取率最大，然后隨提取時間的增加提取率下降。等高線為橢圓可知提取溫度和提取時間的交互作用對山藥多糖提取率影響顯著。由圖7和圖8的等高線可知，提取溫度和pH的交互作用對山藥多糖提取率的影響不顯著，pH和提取時間的交互作用對山藥多糖提取率影響不顯著。

2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個因素的特征值有正有負，表明此二次響應面是鞍面，無極值存在;同時，這與以上響應面圖的直觀顯示結果是一致的。因此不能直接從此二次響應面上找出最佳工藝參數，需要進一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時間進行Sort由小到大的排序，再運用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應面回歸模型進行嶺嵴分析，嶺嵴分析結果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時間的增大而增大。當R最大為1.0時即試驗最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時間為163.5 min來進行驗證試驗，此時山藥多糖提取率為6.082%，與預測值基本一致。

3 ? 結論

通過單因素試驗和響應面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

參考文獻：

[1] 陳佳希，李多偉.山藥的功能及有效成分研究進展[J].西北藥學雜志，2010，25（5）：398-340.

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2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個因素的特征值有正有負，表明此二次響應面是鞍面，無極值存在;同時，這與以上響應面圖的直觀顯示結果是一致的。因此不能直接從此二次響應面上找出最佳工藝參數，需要進一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時間進行Sort由小到大的排序，再運用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應面回歸模型進行嶺嵴分析，嶺嵴分析結果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時間的增大而增大。當R最大為1.0時即試驗最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時間為163.5 min來進行驗證試驗，此時山藥多糖提取率為6.082%，與預測值基本一致。

3 ? 結論

通過單因素試驗和響應面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

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2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個因素的特征值有正有負，表明此二次響應面是鞍面，無極值存在;同時，這與以上響應面圖的直觀顯示結果是一致的。因此不能直接從此二次響應面上找出最佳工藝參數，需要進一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時間進行Sort由小到大的排序，再運用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應面回歸模型進行嶺嵴分析，嶺嵴分析結果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時間的增大而增大。當R最大為1.0時即試驗最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時間為163.5 min來進行驗證試驗，此時山藥多糖提取率為6.082%，與預測值基本一致。

3 ? 結論

通過單因素試驗和響應面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

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3 ? 結論

通過單因素試驗和響應面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

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