豬精液冷凍保存的劑型及品種效應

劉德玉+楊尚雪+黃明光+李美珍+李珣+潘天彪+黃光云+胡傳活

摘要：為了評價細管類型在不同品種公豬精液冷凍中的效果，為豬精液冷凍的實際生產中冷凍細管的選擇提供理論依據，試驗將長白、大約克與杜洛克3種美系公豬（每品種7頭次）精液進行不同細管類型（5.00、0.50、0.25 mL）的分裝冷凍，比較各種細管類型下不同品種公豬之間和同一品種公豬不同細管類型精液凍后質量（凍后精子活力、畸形率及頂體完整率）。結果表明，①相同劑型下，除了0.25 mL細管分裝時杜洛克公豬凍后精子頂體完整率顯著（P<0.05）高于長白公豬外，3種公豬之間在3個指標上差異均不顯著（P>0.05）;②3種公豬凍后精子活力最高的劑型均為0.50 mL細管，凍后精子畸形率及頂體完整率最好的劑型均為5.00 mL細管?？傊?，3種細管類型中，僅0.25 mL劑型存在品種效應，而3個品種公豬卻存在著基本類似的劑型效應。

關鍵詞：豬;精液;冷凍保存;劑型;品種

中圖分類號：S828 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4917-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.038

Effects of Package Type and Breed on the Cryopreservation of Boar Semen

LIU De-yu1，2，YANG Shang-xue3，HUANG Ming-guang1，LI Mei-zhen2，LI Xun3，PAN Tian-biao1，

HUANG Guang-yun1，HU Chuan-huo3

（1. Guangxi Institute of Animal Sciences/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement， Nanning 530001， China; 2. Guangxi Work Station of Livestock & Poultry Breed Improvement， Nanning 530001， China; 3. College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： To evaluate the effects of straw type on cryopreservation of semen from various breeds of boars and provide a theorectical reference for choosing one suitable straw in production practice of frozen semen， the semens of three kinds of American-derived boar （Landrace， large Yorkshire and Duroc） were packed / frozen with three different types of straws including 5.00 mL， 0.50 mL and 0.25 mL. Each breed had seven samples of semen. The evaluation indexes were made up of the sperm motility， abnormality and acrosomal integrity after frozen among three breeds and straw types. The results showed that for the same straw type， there had no significant differences（P>0.05） among the three breeds except from the acrosomal integrity of Duroc boar at 0.25 mL package significantly higher than that of Landrace boar（P<0.05）. For three breeds， the package type with the highest sperm motility was at 0.50 mL straw. And at 5.00 ml straw， the abnormality and acrosomal integrity was the best. It is indicated that there had breed effect only in the 0.25 mL straw type and while it showed analogous package-type effect in the three breeds.

Key words： boar; semen; cryopreservation; package type; breed

早期的豬精液冷凍技術研究中，豬精液采用玻璃瓶或玻璃試管和較高濃度的甘油溶液進行冷凍保存。后來，牛的粒狀干冰法被應用到豬上，把甘油溶液濃度降到1%～3%，可以實行快速冷凍降溫操作[1]。隨后，豬精液冷凍技術又采用多種分裝方式，有5.00 mL大型細管、5.00 mL不同類型的塑料袋、4.00～5.00 mL鋁袋、1.70～2.00 mL扁平細管、0.50 mL中型細管以及0.25 mL微型細管，但不同的分裝方式凍后精液質量不盡相同。目前，尚未有研究小組將常用的冷凍分裝方式在相同的條件下進行系統(tǒng)的比較，以確定較優(yōu)的承載工具，為實際的凍精生產中承載工具的選擇提供有價值的理論依據?；诩毠芊ㄊ切陆l(fā)展起來的冷凍方法，采用細管法便于保存，有助于提高精液的利用率，本試驗試圖比較眾多的冷凍保存承載工具中細管劑型（5.00、0.50、0.25 mL）對豬精液凍后質量的影響，從而為豬凍精的實際生產中細管劑型的選擇提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試劑及樣品 ?葡萄糖由天津市科密歐化學試劑有限公司提供，檸檬酸由國藥集團化學試劑有限公司提供，三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane， Tris）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC）、青霉素與鏈霉素由北京索萊寶科技有限公司提供，甘油由汕頭市西隴化工廠有限公司提供，卵黃取自南寧市富鳳農牧有限公司生產的初產雞蛋，0.25、0.50及5.00 mL塑料細管由Minitube公司提供。

新鮮精液用手握法采自廣西科達畜禽改良有限責任公司飼養(yǎng)的健康、性欲旺盛的美系長白、大約克及杜洛克種公豬，每品種采集7頭次，收集富含精子段的精液于預溫的潔凈燒杯中，1 h內送達實驗室。先用8層紗布過濾，然后檢查精子活力、畸形率及密度?；盍?gt;0.7，畸形率<20%的精液繼續(xù)用于后續(xù)試驗。

1.1.2 ?主要儀器 ?冰箱（Haier集團）、移液槍（Eppendorf）、相差顯微鏡（Olympus）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、電子恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）、程序降溫儀（IMV卡蘇公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?精液冷凍-解凍程序 ?10層紗布包裹精液，置于室溫下緩慢降溫，然后與稀釋液[2]（表1）等溫混合（稀釋比為1∶2，即先加入1份稀釋液，混合均勻，室溫下平衡15 min后，再加入另1份稀釋液）。分別以0.25、0.50及5.00 mL塑料管分裝，10層以上紗布包裹，置于冰箱內5 ℃平衡4 h。

取出塑料管，檢查平衡后活力合格待放入程序降溫儀冷凍（5～-5 ℃，3 ℃/min;-5～-42 ℃，100 ℃/min;-42 ℃～-140 ℃，30 ℃/min;最后停留2 min），完成后取出塑料管迅速投入液氮中。解凍時，從液氮中取出塑料管，迅速投入37 ℃水浴30～60 s。

1.2.2 ?精液凍后質量評估

1）活力。從解凍后的精液抽取5 μL滴于載玻片上，加蓋玻片后在相差顯微鏡下觀察5個視野，每個視野至少200個精子。

2）畸形率及頂體完整率。參考Zou等[3]的方法染色后于相差顯微鏡下觀察，每個處理制片2張，每片至少統(tǒng)計200個精子。

1.2.3 ?試驗設計 ?試驗按塑料管容量分5.00、0.50、0.25 mL 3個組，每個品種重復7次。

1.2.4 ?數據處理 ?所得數據均以平均值±標準差表示，并用SPSS軟件處理，分別進行相同劑型3種公豬之間和同種公豬不同劑型之間3個指標的差異顯著性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?相同劑型下3種公豬精液凍后質量的比較

從表2可知，除了0.25 mL細管分裝時杜洛克公豬凍后精子頂體完整率顯著（P<0.05）高于長白公豬外，相同劑型下3種公豬之間在凍后精子活力、畸形率及頂體完整率上差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 ?同種公豬下不同劑型精液凍后質量的比較

從表2可知，在凍后精子活力上，3種公豬均是0.50 mL劑型組最高，雖然在大約克和杜洛克公豬該劑型組與0.25 mL劑型組差異不顯著（P>0.05），但顯著高于5.00 mL劑型組（3種公豬）及0.25 mL劑型組（長白公豬）（P<0.05）。在凍后精子畸形率上，長白、杜洛克公豬5.00 mL劑型組顯著低于0.25 mL劑型組（P<0.05），該2個劑型與0.50 mL劑型組對比或大約克公豬3個劑型之間對比差異均不顯著（P>0.05），3種公豬均為5.00 mL劑型組最低。在凍后精子頂體完整率上，3種公豬均為5.00 mL劑型組最高，而且隨著劑型變小，頂體完整率有降低的趨勢。

2.3 ?公豬之間較優(yōu)劑型精液凍后質量的比較

從表2可知，3種公豬凍后精子活力最高的劑型均為0.50 mL，凍后精子畸形率及頂體完整率最好的劑型均為5.00 mL，而且同一指標在不同品種之間均不存在顯著差異（P>0.05）。

3 ?討論

目前，冷凍時用細管分裝牛精液已經比較普遍[4-6]，在豬精液冷凍方面也已經由傳統(tǒng)的塊狀或顆粒型轉為細管型[7-10]，但將常用細管的冷凍效果進行對比的報道較少[11]。本試驗比較了3種常用細管（5.00、0.50、0.25 mL）應用于豬精液冷凍時的效果，其中包括精子活力、畸形率及頂體完整率等3個能體現凍后精子質量的最基本指標的對比。相同劑型下3種公豬之間精液凍后質量的比較結果表明，除了0.25 mL細管分裝時在凍后精子頂體完整率上存在品種效應外，3個劑型在凍后精子活力、畸形率及頂體完整率上均沒有品種效應，其原因尚需進一步研究分析。

同種公豬下不同劑型精液凍后質量的比較結果表明，3種劑型中，0.50 mL細管分裝的精液凍后精子活力在3種公豬均為最高，5.00 mL細管分裝的精液凍后精子畸形率及頂體完整率均最好，提示細管的形狀對豬精液凍后質量影響較大，可能由于凍后豬精液解凍時釋放潛伏熱受表面積/體積的影響，用較大的表面積/體積的載體分裝后冷凍，精子形態(tài)較好[1]。5.00 mL細管的長度和直徑較大，所以其承載的豬精子凍后形態(tài)較好，但用其冷凍豬精液在技術上還有一些難點，例如使用大直徑細管冷凍，會使冷凍速率變慢，熏蒸時間變長，管內精液異源性更高，導致更高的精子損傷率，不均勻的解凍速率也將導致凍后精子活率降低[1]。本試驗結果表明，三種劑型承載的精液凍后精子活力從高到低是0.50、0.25和5.00 mL，這與Bwanga等[12]及Cordova等[13]的研究結果相似;而凍后精子頂體完整率的結果與2個研究小組的研究結果相反，本試驗中，5.00 mL承載的精液凍后精子頂體完整率最高，且隨著劑型變小，頂體完整率有降低的趨勢。這可能是因為試驗所使用的冷凍保存稀釋液不同，而稀釋液所含成分對豬精液凍后質量有很大的影響。其次，稀釋的方法不同，本試驗將稀釋液分兩次加入到精液中，但是兩次添加的稀釋液中均含有甘油，研究顯示甘油對精子具有保護作用的同時也有一定的毒害作用[14，15]。再次，本試驗所使用的指標測定方法不同，本試驗采用考馬斯亮藍染色后在相差顯微鏡下觀察計數，而Bwanga研究小組所使用的方法是署紅-苯胺黑染色后電鏡下觀察。最后，指標測定人員不同可能也是影響試驗結果的重要因素。李林林[16]研究發(fā)現，顆粒、0.25 mL細管、5.00 mL細管冷凍后精子活力和活率的差異不顯著，這與本試驗的結果相同（5.00 mL與0.25 mL承載的3種公豬凍后精子活力差異均不顯著）。

Watson[17]在總結精液受精力與具備正常功能的活精子數的關系時認為，只有正常功能的精子數達到一定臨界值時，精液的受精力才能得到保證。5.00 mL大型細管長度與直徑大，便于分裝并節(jié)約時間，且1支細管就具有1頭份的輸精劑量，方便輸精。0.25 mL小型細管和0.50 mL中型細管，1頭份的輸精劑量一般需要20～10根細管，因此不利于輸精和生產上普遍推廣。本試驗研究結果顯示，5.00 mL細管凍后精子畸形率最低，頂體完整率最高，是3種劑型中更有利于凍精實際生產的細管。但對于5.00 mL劑型凍后精子活力較低的原因還需進一步研究，以便加快其商業(yè)應用的步伐。

4 ?結論

在本試驗條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細管。

參考文獻：

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4 ?結論

在本試驗條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細管。

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4 ?結論

在本試驗條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細管。

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