川貝母多倍體誘導(dǎo)條件的優(yōu)化及含量測(cè)定

江明殊+王躍華+劉濤+范文萍+楊敏+王曉蓉

摘要：采用正交試驗(yàn)法考察秋水仙素濃度、浸泡時(shí)間、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)、處理溫度對(duì)川貝母（Fritillaria cirrhosa）愈傷組織多倍體誘導(dǎo)的影響。以多倍體誘導(dǎo)率為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，篩選最佳誘導(dǎo)條件。在考察的因素中，對(duì)川貝母多倍體誘導(dǎo)率影響的大小次序依次為秋水仙素濃度>浸泡時(shí)間>二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)>處理溫度。多倍體誘導(dǎo)條件的最優(yōu)組合是秋水仙素濃度為900 mg/L、浸泡時(shí)間為48h、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為4%、處理溫度為20 ℃，在此條件下，其誘導(dǎo)率可達(dá)94.3%;細(xì)胞染色體鑒定結(jié)果為四倍體染色體數(shù)為2n=4x=48，誘導(dǎo)后的愈傷組織為多倍體;對(duì)野生、組培二倍體、組培多倍體川貝母鱗莖進(jìn)行有效藥用成分生物堿總含量測(cè)定，其中組培多倍體生物堿總含量最高為0.657%。

關(guān)鍵詞：川貝母（Fritillaria cirrhosa）;愈傷組織;多倍體;生物堿;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q813.1+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4903-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.034

Optimizing the Conditions of Inducing Polyploid of Fritillaria cirrhosa

and Content Determination

JIANG Ming-shu1，2，WANG Yue-hua2，LIU Tao2，F(xiàn)AN Wen-ping2，YANG Min2，WANG Xiao-rong3

（1. Life Science College，Sichuan Normal University，Chengdu 610101， China;2. Chengdu Faculty of Biotechnology Institute，Chengdu University，Chengdu 610106， China;3. Enwei Investment（Group） Ltd. Corporation，Chengdu 610200， China）

Abstract：The induction rate of optimized conditions of Fritillaria cirrhosa including the concentration of colchcine，the time of being soaked in colchcine，the volume fraction of dimethyl sulfoxide and temperature was determined by orthogonal text. A optimal combination was screened through the crossed test of L9（34）. The order of factors ?affecting the induction rate was the concentration of colchcine> the time of being soaked in colchcine> the volume fraction of dimethyl sulfoxide> temperature. The optimal combination was the concentration of colchcine 900 mg/L，the time of being soaked in colchcine 48 h，the volume fraction of dimethyl sulfoxide 4%，temperature ?20 ℃， with induction rate of 94.3%. Compared with the chromosomal number，it was proved that the callus of F. cirrhosa was polyploidy. The contents of total bio-medicinal ingredients with wild，tissue culture of diploid and polyploid bulbs of F. cirrhosa were effectively determinated. The total alkaloid content of polyploid bulbs of F. cirrhosa was the highest with up to 0.657%.

Key words：Fritillaria cirrhosa ;callus;polyploidy;alkaloid;orthogonal test

川貝母（Fritillaria cirrhosa）為名貴川產(chǎn)道地藥材，主要用于治療肺熱燥咳、痰多胸悶等癥，主要分布于我國(guó)西南部橫斷山區(qū)海拔2 800～4 700 m的高山灌叢或草地中。

目前川貝母藥用資源短缺，但有報(bào)道稱藥用植物多倍體可大幅度提高藥材的產(chǎn)量[1-3]。多倍體植物往往具有器官巨大的特點(diǎn)，并且由于細(xì)胞染色體加倍，染色體上基因調(diào)控產(chǎn)生的有效化學(xué)成分含量也往往較正常二倍體高。因此通過(guò)組織培養(yǎng)與多倍體誘導(dǎo)相結(jié)合的方式生產(chǎn)其藥用活性成分總生物堿，以緩解需求與藥材供給、資源枯竭之間的矛盾。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

二倍體組培愈傷組織來(lái)自成都大學(xué)組培室，市售川貝母鱗莖購(gòu)于成都市同仁堂藥店。

1.2 ?儀器與試劑

超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;紫外分光光度計(jì)，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;多段可編程光照培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司;西貝母堿：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)20110706;乙醇（95%）：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20110823;甲醇：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100213;三氯甲烷：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20110524;濃氨水：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20120220;溴甲酚綠：成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20101028;磷酸二氫鉀：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20121117;氫氧化鈉：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20090228;水為去離子水。

1.3 ?方法

1.3.1 ?正交試驗(yàn)因素與水平 ?王強(qiáng)等[4]、 王躍華

等[5]采用單因素試驗(yàn)考察了秋水仙素濃度、浸泡時(shí)間對(duì)川貝母愈傷組織多倍體誘導(dǎo)的影響，但是影響多倍體誘導(dǎo)的因素很多，而單因素試驗(yàn)不能綜合考慮各個(gè)因素的影響，因此本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法。試驗(yàn)選擇了秋水仙素濃度、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、處理溫度4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用正交試驗(yàn)L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)（表1）。

1.3.2 ?愈傷組織的誘導(dǎo) ?在超凈工作臺(tái)上，將川貝母無(wú)菌鱗莖切成0.8 cm見(jiàn)方的小塊，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中，每天光照12 h，光照強(qiáng)度為1 200 lx，培養(yǎng)溫度為21 ℃，30 d繼代培養(yǎng)一次。

1.3.3 ?多倍體的誘導(dǎo) ?按照表2的設(shè)計(jì)，進(jìn)行9組試驗(yàn)。在超凈工作臺(tái)上，將川貝母愈傷組織切成0.8 cm見(jiàn)方的小塊， 放入含不同濃度（600～1 200 mg/L）秋水仙素和添加了二甲基亞砜的混合溶液中，浸泡時(shí)間為24～48 h，處理溫度為15～25 ℃。每組試驗(yàn)浸泡30塊川貝母愈傷組織。

1.3.4 ?多倍體的培養(yǎng) ?按照正交設(shè)計(jì)作不同的處理，處理結(jié)束后用無(wú)菌去離子水沖洗3次，轉(zhuǎn)接入不含秋水仙素的增殖培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.6 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L中讓其恢復(fù)生長(zhǎng)，每組接15瓶， 每瓶2塊。 先暗培養(yǎng)5 d， ?之后再進(jìn)行光照培養(yǎng)， 每天光照12 h， 光照強(qiáng)度為1 200 lx， 溫度為21 ℃。

1.3.5 ?多倍體的鑒定 ?取誘導(dǎo)后的川貝母愈傷組織適量于2 g/L秋水仙素溶液中預(yù)處理2.5 h左右，水洗后用甲醇-冰醋酸（體積比3∶1）固定液固定4 h，再用混合酶（纖維素酶和果膠酶各占25 g/L）在25 ℃恒溫箱內(nèi)處理3 h，倒去酶液，用去離子水洗3次，每次2 min，除去去離子水后制備細(xì)胞懸液，用懸滴法[6]制片，干燥后，用Giemsa染色后觀察。

1.3.6 ?總生物堿含量的測(cè)定 ?參照參考文獻(xiàn)[7]里川貝母項(xiàng)下方法，取西貝母堿5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入三氯甲烷至刻度，搖勻，備用。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL置于25 mL具塞試管中，分別補(bǔ)加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，參照紫外-可見(jiàn)分光光度法在415 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，西貝母堿濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定其總生物堿含量。精密稱取烘干至恒重的野生川貝母鱗莖、二倍體組培愈傷組織、多倍體愈傷組織樣品各2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加濃氨水3 mL，浸潤(rùn)1 h，加三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液40 mL，置于80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷過(guò)濾，濾液置于50 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液至刻度，搖勻。精密量取2～5 mL，置于25 mL具塞試管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使其溶解，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液，待用。以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，參照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在415 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用回歸方程[8]計(jì)算其總生物堿的含量?？偵飰A含量=（A+0.012）×n/（W×106×0.010 8）×100%，式中，A——吸光度;n——稀釋倍數(shù);W——試樣質(zhì)量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?愈傷組織的獲得

將川貝母無(wú)菌鱗莖小塊置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中培養(yǎng)20 d左右，鱗莖切口處出現(xiàn)淡綠色愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的顏色逐漸加深，繼續(xù)繼代培養(yǎng)30 d，即可獲得大量的川貝母愈傷組織。

2.2 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 ?直觀分析結(jié)果 ?根據(jù)正交試驗(yàn)L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，30 d左右對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。以多倍體誘導(dǎo)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，并確定其最優(yōu)組合。

為了直觀起見(jiàn)，以因素為橫坐標(biāo)，誘導(dǎo)率為縱坐標(biāo)，作效應(yīng)曲線（圖1）。由表2可知，各因素對(duì)多倍體誘導(dǎo)率的影響次序?yàn)椋呵锼伤貪舛?gt;浸泡時(shí)間>二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)>處理溫度， 秋水仙素濃度為主要因素，處理溫度為次要因素， 最優(yōu)組合是A2B3C3D3，即秋水仙素濃度為900 mg/L， 浸泡時(shí)間為48 h，添加的二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為4%， 處理溫度為25 ℃。由圖1可知，秋水仙素濃度在600～900 mg/L范圍內(nèi)， 多倍體誘導(dǎo)率隨著秋水仙素濃度的增加而升高。這與王強(qiáng)等[4]在秋水仙素誘導(dǎo)川貝母愈傷組織多倍體研究中的結(jié)論相符。秋水仙素濃度在900～1 200 mg/L范圍內(nèi)， 多倍體誘導(dǎo)率隨著秋水仙素濃度的增加反而有所降低， 因?yàn)楦邼舛鹊那锼伤貙?duì)細(xì)胞的傷害作用增大， 愈傷組織的受害率增加，進(jìn)而影響其誘導(dǎo)率。

2.2.2 ?方差分析結(jié)果 ?直觀分析法不能估計(jì)試驗(yàn)誤差大小，也不知道分析的精度[9]，因此需采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

由方差分析可知，本試驗(yàn)中的秋水仙素濃度、浸泡時(shí)間、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)都對(duì)多倍體的誘導(dǎo)率影響顯著，而處理溫度對(duì)多倍體的誘導(dǎo)率影響不顯著。根據(jù)直觀分析結(jié)果，綜合考慮確定川貝母的最適培養(yǎng)溫度為20～21 ℃，其最優(yōu)組合為A2B3C3D2，即秋水仙素濃度為900 mg/L，浸泡時(shí)間為48 h，添加的二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為4%，處理溫度為20 ℃。

2.2.3 ?驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 ?由于本試驗(yàn)的最優(yōu)組合未在試驗(yàn)組中出現(xiàn)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按照最佳工藝條件A2B3C3D2對(duì)川貝母愈傷組織進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，結(jié)果多倍體誘導(dǎo)率為94.3%，誘導(dǎo)率較高，優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。因此本試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B3C3D2，即秋水仙素濃度為900 mg/L，浸泡時(shí)間為48 h，二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為4%，處理溫度為20 ℃。

2.3 ?多倍體鑒定結(jié)果

取誘導(dǎo)后的川貝母愈傷組織進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)，并進(jìn)行顯微拍照，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。對(duì)照組的染色體數(shù)2n=24，誘導(dǎo)組的染色體數(shù)2n=48，由此可以確定誘導(dǎo)后的川貝母愈傷組織為多倍體。

2.4 ?含量測(cè)定結(jié)果

按照參考文獻(xiàn)[7]川貝母項(xiàng)下進(jìn)行，在415 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、取樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=10.663X-0.001 0，r=0.999 8，結(jié)果顯示取樣量在0.004 88～0.035 04 mg有良好的線性關(guān)系。

測(cè)定各樣品的吸光度并計(jì)算其生物堿總含量（表3）。試驗(yàn)結(jié)果顯示野生川貝母鱗莖生物堿總含量為0.237%，組培二倍體愈傷組織生物堿總含量為0.249%，經(jīng)最佳處理培育的組培多倍體愈傷組織生物堿總含量為0.657%。

2.5 ?生物堿總含量的比較結(jié)果

由表4可知，組培多倍體愈傷組織生物堿總含量較組培二倍體愈傷組織、野生川貝母鱗莖均高，幾乎是后二者的3倍。分析原因可能是組培多倍化后的川貝母隨著其染色體加倍，細(xì)胞內(nèi)有效成分也隨著加倍。且經(jīng)組培的川貝母在人為管理下，其生長(zhǎng)環(huán)境更有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的積累，所以結(jié)果中顯示出組培二倍體愈傷組織生物堿總含量大于野生川貝母鱗莖。因此，采用多倍體誘導(dǎo)技術(shù)可以快速使有效成分生物堿的含量增加。這不僅可以改善長(zhǎng)期以來(lái)采挖野生川貝母為藥用資源的現(xiàn)狀，而且對(duì)野生川貝母資源的保護(hù)起到了積極作用。

3 ?討論

近年來(lái)在許多藥用植物誘導(dǎo)獲得多倍體的研究中，多采用秋水仙素對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行處理，誘導(dǎo)率普遍為30%左右[10]。本試驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)，考察了包括秋水仙素濃度、浸泡時(shí)間、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)、處理溫度對(duì)川貝母愈傷組織多倍體誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)秋水仙素濃度為900 mg/L、浸泡時(shí)間為48 h、二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為4%、處理溫度為20 ℃時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率最佳。

試驗(yàn)表明，當(dāng)二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為0～4%時(shí)，多倍體的誘導(dǎo)率一直增高，而且與相關(guān)研究的多倍體誘導(dǎo)率比較，本試驗(yàn)川貝母多倍體誘導(dǎo)率有所提高。如王強(qiáng)等[4]在秋水仙素誘導(dǎo)川貝母愈傷組織多倍體的研究中，誘導(dǎo)率最高為70%，而本試驗(yàn)誘導(dǎo)率高達(dá)94.3%。分析其原因?yàn)槎谆鶃嗧渴且环N滲透劑，它能提高細(xì)胞壁的透性[11]，從而有利于秋水仙素進(jìn)入植物細(xì)胞，這就增大了秋水仙素分子與微管蛋白二聚體結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而使微管蛋白的形成受阻，進(jìn)而抑制或妨礙細(xì)胞的紡錘絲形成，使分裂的染色體停留在赤道板，不向兩級(jí)移動(dòng)，導(dǎo)致染色體數(shù)目增加。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的二甲基亞砜對(duì)川貝母愈傷組織多倍體的誘導(dǎo)率具有增效作用。

為確定多倍化川貝母對(duì)生物堿含量的影響，本試驗(yàn)將經(jīng)多倍化誘導(dǎo)的川貝母與組培二倍體愈傷組織以及野生川貝母鱗莖進(jìn)行了生物堿總含量測(cè)定。結(jié)果表明，組培多倍化后的川貝母生物堿總含量最高。目前，已知生物堿是貝母屬植物的藥用有效成分，甾類生物堿又是其主要類型[12]。大多數(shù)的植物通過(guò)甲戊羥酸途徑合成甾類化合物，川貝母甾類生物堿的合成也被認(rèn)為是主要通過(guò)此途徑完成[13，14]。在合成的途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是一種比較重要的酶。隨著對(duì)HMGR研究的深入，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，一些生物或非生物刺激可以調(diào)節(jié)HMGR的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平，從而對(duì)下游甾類化合物的生物合成進(jìn)行人為調(diào)控[15，16]。本試驗(yàn)所采用的4種因素對(duì)川貝母進(jìn)行的多倍體誘導(dǎo)是否間接影響了生物堿的合成還有待進(jìn)一步研究。

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