外源硅酸鈉對(duì)砂糖橘抗寒性的影響

范七君+牛英+劉萍+劉冰浩+婁兵海+陳國平+冷付春+覃旭

摘要：以一年生砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）為材料，以噴施去離子水為對(duì)照，比較了噴施0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L不同濃度外源硅酸鈉（Na2SiO3）溶液處理后，砂糖橘葉片在4 ℃低溫條件下的生理變化。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，在4 ℃低溫脅迫下，Na2SiO3預(yù)處理的砂糖橘葉片葉綠素含量增加，SOD、POD等抗氧化酶活性升高，相對(duì)電導(dǎo)率降低。說明外源Na2SiO3能提高砂糖橘的抗寒性，其中以0.1 mmol/L的Na2SiO3溶劑處理的效果最好。

關(guān)鍵詞：砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）;抗寒性;硅酸鈉

中圖分類號(hào)：S666.2;S426;S143.7+9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4874-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.027

Effects of Exogenous Sodium Silicate on Cold Tolerance

of Citrus reticulata cv. Shatangju

FAN Qi-jun1，NIU Ying1，LIU Ping1，LIU Bing-hao1，LOU Bing-hai1，CHEN Guo-ping2，

LENG Fu-chun1，QIN Xu1

（1. Guangxi Citrus Biology Key Laboratory，Guangxi Academy of Specialty Crops， Guilin 541004， Guangxi， China;

2. Guangxi Agriculture Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530022， China）

Abstract： To elucidate the roles of Sodium silicate （Na2SiO3） in enhancing tolerance of cold stress （4 ℃） in Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju， one-year old nursery cultured C. reticulata cv. Shatangju was used to investigate the physiological changes of plants exposing to 4 ℃ low temperature stress after pretreated with different Na2SiO3 concentration of 0 mmol/L， 0.1 mmol/L， 1.0 mmol/L， 10.0 mmol/L and 20.0 mmol/L. The results showed that comparing with the control plants （0 mmol/L Na2SiO3） ， the Na2SiO3 pretreated plants had more chlorophyll and higher antioxidant activities of enzymes including SOD， POD. Relative conductivity was reduced. It is indicated that exogenous Na2SiO3 enhanced the cold tolerance of low temperature stress in C. reticulata cv. Shatangju. The 0.1 mmol/L pretreatment had the best effects.

Key words： Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju; cold tolerance; Sodium silicate

中國大部分地區(qū)的農(nóng)作物在其生長周期內(nèi)都會(huì)遭受低溫天氣的傷害，尤其是在南方地區(qū)，雖然南方冬季的絕對(duì)溫度不低，但是許多熱帶、亞熱帶作物忍受低溫的能力較差，當(dāng)冬天的氣溫在0 ℃以上時(shí)也時(shí)常遭受低溫傷害，這種低溫傷害對(duì)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)會(huì)造成一定的影響。砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）是廣西壯族自治區(qū)主栽的優(yōu)良柑橘品種之一，但是砂糖橘也不耐低溫，冬季經(jīng)常遭受低溫傷害。

硅（Silicon，Si）是地殼中含量豐富的元素。雖然目前尚無足夠的證據(jù)證明硅是植物生長的必需元素，但是越來越多的研究表明，硅對(duì)禾本科（Gramineae）等植物的健康生長是有益的[1]。近年研究表明，硅能提高植物對(duì)鹽害、干旱及重金屬脅迫等的抗逆性[2-4]。關(guān)于硅對(duì)植物抗寒性影響的研究報(bào)道相對(duì)較少，僅在小麥（Triticum aestivum L.）[5]、黃瓜（Cucumis sativus L.）[6]等作物上有相關(guān)報(bào)道;研究表明，施硅能提高低溫脅迫條件下小麥幼苗的凈光合速率（Net photosynthetic rate）、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance）、水分利用率（Water use efficiency），減緩低溫脅迫對(duì)葉綠素（Chlorophyll）含量和可溶性糖（Soluble sugar）含量的影響;加硅處理能使低溫脅迫下的黃瓜幼苗超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性顯著升高，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物陰離子自由基（Superoxide anion radical，■）下降，可減少低溫脅迫對(duì)黃瓜幼苗的傷害。然而對(duì)于硅提高植物抗寒性的機(jī)理還不是十分清楚。為此，試驗(yàn)以廣西壯族自治區(qū)主栽柑橘品種砂糖橘為材料，從生理生化方面比較外源硅酸鈉（Na2SiO3）對(duì)低溫脅迫下砂糖橘抗寒性的影響，以期為闡明硅提高植物抗寒性的機(jī)理提供參考，并為砂糖橘田間施用硅肥、以減少低溫傷害提供技術(shù)支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以一年生枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]砧砂糖橘為材料，用Na2SiO3為外源硅;砂糖橘定植于黑色塑料營養(yǎng)袋中，每袋種植1株。每個(gè)處理4袋（株）， Na2SiO3溶液濃度分別為0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L，4個(gè)Na2SiO3處理加1個(gè)對(duì)照處理共計(jì)20株苗。每天在每株葉面和根等部位分別噴施50 mL Na2SiO3溶液;對(duì)照每天在每株葉面和根等部位噴施50 mL去離子水。14 d后，在智能人工氣候箱中4 ℃低溫處理24 h，分別于0、1、6、12、24 h在相同部位取葉樣。樣品一部分即時(shí)用于電導(dǎo)率和葉綠素含量的測定，另一部分置于液氮中保存，用于抗氧化酶活性的測定。

1.2 ?測定方法

1.2.1 ?相對(duì)電導(dǎo)率（Relative conductivity，REC）測定相對(duì)電導(dǎo)率測定參考文獻(xiàn)[7]的方法，略作修改。取0.1 g葉片，去離子水沖洗3次，避開葉脈剪碎，加入5 mL去離子水，400 r/min振蕩2 h后，測定電導(dǎo)率值C1，而后100 ℃沸水煮沸10 min，冷卻至室溫后再測定電導(dǎo)率值C2，按下式計(jì)算求得REC，

REC=C1/C2×100%。

1.2.2 ?葉綠素含量測定 ?葉綠素含量測定參考文獻(xiàn)[7]的方法，略有改動(dòng)。取0.1 g（FW） 葉片在1 mL 80 %（V/V）的丙酮中研磨成勻漿，并在黑暗中靜置15 min。然后將上述粗提液于室溫下10 000 r/min離心20 min，所得上清液0.5 mL（V）在Cary50UV-Vis分光光度計(jì)上分別于663、645和480 nm 處比色，分別讀取OD值A(chǔ)1、A2、A3。葉綠素含量分別按下式計(jì)算：

葉綠素a（Ca）含量：Ca=12.72×A1-2.59×A2;

葉綠素b（Cb）含量：Cb=12.72×A2-2.59×A1;

總?cè)~綠素[C（a+b）]含量：C（a+b）=20.29×A2-8.05×A1;

樣品中葉綠素含量=C（a+b）×V/FW。

式中，V為葉綠素總的提取液體積（mL），F(xiàn)W為樣品鮮重（g）。

1.2.3 ?抗氧化酶活性測定 ?① 酶液的提取。稱取樣品0.5 g，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），于研缽（冰浴）中研磨成勻漿，用磷酸緩沖液定容到5 mL，然后在4 ℃、10 000 r/min高速冷凍離心機(jī)中離心20 min，上清液即為待測酶液。② 蛋白測定。樣品蛋白含量測定參考文獻(xiàn)[8]的方法，上述酶液用考馬斯亮藍(lán)染色后于Cary 50 UV-Vis分光光度計(jì)上在595 nm處讀取OD值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。③ SOD活性測定。SOD活性測定采用NBT法，參考文獻(xiàn)[9]的方法，略有改動(dòng)。在3 mL的酶反應(yīng)體系中含有1.5 mL 0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）、0.3 mL 130 mmol/L的蛋氨酸溶液、0.3 mL 750 μmol/L的NBT溶液、0.3 mL 100 μmol/L的EDTA-Na2溶液、50 μL的待測酶液、0.25 mL的去離子水、0.3 mL 0.05 mol/L的核黃素溶液（pH 7.0）。依次加入以上成分后，在溫度為25 ℃、光照為4 000 Lx條件下靜置20 min，以磷酸緩沖液代替酶液作為對(duì)照，對(duì)照設(shè)置光對(duì)照和暗對(duì)照各1個(gè)，光對(duì)照同樣品一起在光照下靜置20 min，暗對(duì)照在黑暗中靜置20 min。把暗對(duì)照調(diào)零，測定在560 nm處的OD值，計(jì)算出不同酶液量在反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對(duì)百分率，以出現(xiàn)50%抑制率的酶液量（μL）作為一個(gè)酶活單位（U）。按下式計(jì)算SOD活性：

SOD活性[U/g（protein）]=（AL-AS）×VT/（0.5× AL×VS×W）。

式中，AL為光對(duì)照的OD值，AS為樣品的OD值，VT為提取酶液總體積（mL），VS為測定時(shí)所用酶液的體積（mL），W為樣品的蛋白質(zhì)量（g）。④ POD活性測定。POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，參考文獻(xiàn)[9]的方法。在3 mL的酶反應(yīng)體系中含有1 mL的 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）、1 mL的3‰（V/V）的H2O2、0.95 mL的2‰（V/V）的愈創(chuàng)木酚液、50 μL酶液。反應(yīng)體系最后加入酶液啟動(dòng)反應(yīng)，在470 nm處測定OD值。以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01為一個(gè)POD活性單位，按下式計(jì)算POD活性：

POD活性[U/g（protein）]=（△OD470×VT）/（0.01× W×VS×t）。

式中，△OD470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，VT為提取酶液的總體積（mL），W為樣品的蛋白質(zhì)量（g），VS為測定時(shí)所用酶液的體積（mL），t為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsft Office Excel 2000軟件進(jìn)行處理，再用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較差異顯著性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響情況見圖1。由圖1可知，在4 ℃的低溫脅迫過程中，Na2SiO3處理的葉片其相對(duì)電導(dǎo)率均低于對(duì)照的相對(duì)電導(dǎo)率;在脅迫24 h時(shí)，對(duì)照的相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到了32.33%，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L處理的相對(duì)電導(dǎo)率分別為25.25%、26.27%、27.39%、28.23%，說明噴施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘葉片的抗寒性。其中又以0.1 mmol/L處理的提高抗寒性效果最好。其相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照低21.9%，與對(duì)照存在極顯著差異水平（P<0.01）。

2.2 ?噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片葉綠素含量的影響

噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片葉綠素含量的影響情況見圖2。由圖2可知，在4 ℃低溫脅迫前（0 h），Na2SiO3處理的葉綠素含量與對(duì)照的葉綠素含量沒有差異;而在低溫脅迫24 h時(shí)，對(duì)照的葉綠素含量為79.46 μg/g，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L處理的葉綠素含量分別為129.28、109.35、103.75、92.31 μg/g，，說明噴施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘葉片的葉綠素含量，其中又以0.1 mmol/L處理的效果最好，其葉綠素含量比對(duì)照增加了62.7 %，與對(duì)照存在極顯著差異（P<0.01）。

2.3 ?噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片SOD活性的影響

噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片SOD活性的影響情況見圖3。由圖3可知，在4 ℃低溫脅迫24 h時(shí)，對(duì)照的SOD活性為99.09 [U/g（protein）]，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L處理的SOD活性分別為124.08、114.16、112.28、106.12 [U/g（protein）]，說明噴施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘葉片的SOD活性，其中又以0.1 mmol/L Na2SiO3處理的SOD活性增幅最大，比對(duì)照增加了25.2%，與對(duì)照存在極顯著差異（P<0.01）。

2.4 ?噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片POD活性的影響

噴施外源Na2SiO3對(duì)砂糖橘葉片POD活性的影響情況見圖4。由圖4可知，在脅迫24 h時(shí)，對(duì)照的POD活性為3 380 [U/g（protein）]，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L處理的POD活性分別為4 652、4 072、3 816、3 580 [U/g（protein）]，說明噴施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘葉片的POD活性，其中又以0.1 mmol/L Na2SiO3處理的POD活性增加最多，比對(duì)照增加了37.6 %，與對(duì)照存在極顯著差異（P<0.01）。

3 ?討論

硅肥作為一種新型肥料不僅能夠提高作物的產(chǎn)量，還能改善作物的品質(zhì)，提高作物的抗逆性，已被國際植物營養(yǎng)學(xué)界認(rèn)為是繼氮、磷、鉀之后第四大植物營養(yǎng)元素[10，11]。硅肥在農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)國家已得到廣泛應(yīng)用，中國于20世紀(jì)70年代從日本引入，目前在我國發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用較多。因此試驗(yàn)考察硅肥（硅酸鈉）對(duì)砂糖橘葉片抗寒生理的影響，旨在研究硅肥提高砂糖橘抗寒性的可能機(jī)理，進(jìn)一步為生產(chǎn)上施用硅肥提供一定的技術(shù)支撐。

近年來，硅在提高植物對(duì)鹽害、干旱、重金屬脅迫等抗逆性方面的研究較多[12，13]，然而關(guān)于硅對(duì)柑橘抗寒性的報(bào)道較少。試驗(yàn)對(duì)外源硅（硅酸鈉）能否提高砂糖橘的抗寒性作了初步探討，結(jié)果顯示，在4℃的低溫脅迫下，施硅處理的砂糖橘葉片細(xì)胞受到的傷害較輕，因而細(xì)胞電解質(zhì)外滲少，相對(duì)電導(dǎo)率較小，說明外源硅可以提高砂糖橘葉片的抗寒性。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)生命活動(dòng)之一，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，是綠色葉片進(jìn)行光合作用時(shí)捕獲光能的重要物質(zhì)，其含量的高低在某種程度上與光合作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)[14];但是低溫使葉綠素的合成受到抑制，葉綠素含量明顯下降。在低溫脅迫下，砂糖橘葉片中的葉綠素含量逐漸降低;然而施硅可以緩解低溫脅迫下葉綠素含量下降的幅度，使植株在低溫條件下維持相對(duì)較高的光合速率，從而保障基本的生命活動(dòng)，增強(qiáng)了對(duì)低溫脅迫的抵抗能力。

活性氧（Reactive oxygen species）帶來的氧化傷害是低溫等非生物脅迫中的主要傷害之一。在非生物脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子等自由基，這將對(duì)細(xì)胞膜等產(chǎn)生氧化傷害，超氧化物歧化酶可以把超氧陰離子（O2-）分解為氧分子和過氧化氫（H2O2），過氧化物酶則可以把過氧化氫分解為無毒的水和氧分子，因此超氧化物歧化酶和過氧化物酶在抗氧化酶系統(tǒng)中具有很重要的作用[14]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫脅迫下砂糖橘葉片中超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性先是逐漸增加然后減少，施硅處理的超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性比不施硅處理的高，從而使植株在低溫條件下可免受過多的氧化損傷，維持細(xì)胞器等的正常功能，增強(qiáng)了對(duì)低溫脅迫的抵抗能力。

綜上所述，在低溫脅迫下，加硅（硅酸鈉）處理可以減緩砂糖橘葉片葉綠素的降解，維持相對(duì)較強(qiáng)的光合作用，保證砂糖橘基本新陳代謝的能量需求;同時(shí)可以提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶的活性，緩解活性氧對(duì)細(xì)胞膜等造成的氧化傷害，使砂糖橘在低溫脅迫下保持較正常的細(xì)胞機(jī)能。雖然外源硅（硅酸鈉）處理通過增強(qiáng)光合作用和提高抗氧化能力，提升了砂糖橘對(duì)低溫脅迫的抵抗能力。但是外源硅提高砂糖橘抗寒性的機(jī)制比較復(fù)雜，還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究來不斷完善。

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