DNA條形碼技術(shù)在真菌上的研究與應(yīng)用

徐羅娜+涂敏+王曉芳

摘要：DNA條形碼技術(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)化的小片段DNA序列對物種進行快速鑒定分析，在動植物和微生物分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用，而在真菌鑒定研究中相對滯后。綜述了DNA條形碼的起源、發(fā)展及其在真菌研究中的應(yīng)用，并探討分析了DNA條形碼技術(shù)存在的問題以及未來的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：真菌;DNA條形碼;序列篩選

中圖分類號：Q789;Q949.32 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4790-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.005

DNA Barcoding and Its Application in Studying Fungi

XU Luo-na1， TU Min2，WANG Xiao-fang3

（1. College of applied science and technology， Hainan University， Danzhou 571737，Hainan， China;

2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737，Hainan， China;

3.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： DNA barcoding can provide an efficient method for identifying species rapidly with a standardized short sequence of DNA and is widely used in plants， animals and microorganisms. The study of fungal DNA barcoding is relatively lagging behind. The origin， development of DNA barcoding and its application in studying fungi was reviewed. The problems and prospects of DNA barcoding were discussed.

Key words： fungi; DNA barcoding; sequential selecting

DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是通過一個或多個保守基因在各個物種間進行大范圍的掃描，進而識別和鑒定物種或者發(fā)現(xiàn)新物種的技術(shù)[1]。傳統(tǒng)分類學(xué)通過對物種進行描述和鑒定，完善并形成一套完整體系的信息檢索系統(tǒng)，成功鑒定出170多萬種生物。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，尤其是新興的PCR技術(shù)、遺傳分子學(xué)、高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)等新領(lǐng)域的出現(xiàn)，應(yīng)運而生的DNA條形碼技術(shù)不受生物生長時期形態(tài)學(xué)特征的干擾，能客觀準(zhǔn)確地將物種區(qū)分并鑒定[2-6]。因此，建立一個基于標(biāo)準(zhǔn)分子序列的物種鑒定系統(tǒng)成為全世界科學(xué)家們的宏偉計劃。然而，DNA條形碼計劃是一項需要分類學(xué)、信息學(xué)、軟件處理、硬件研發(fā)、設(shè)備更新等方面協(xié)同作戰(zhàn)的系統(tǒng)工程。本文就DNA條形碼技術(shù)在真菌上的研究與應(yīng)用進行探討，對有效開展真菌的鑒定分類、監(jiān)測檢疫、多樣性保護等具有重要意義。

1 ?DNA條形碼的起源與發(fā)展

DNA條形碼概念起源于2003年在美國冷泉港由Alfred Sloan基金會主辦的DNA條形碼科學(xué)性和社會功能研討會。其被Hebert博士首次提出，即利用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（Cytochrome c oxidase subunit I， COI）的一段特殊區(qū)域作為DNA條形碼的基礎(chǔ)序列，通過比較不同物種間該段序列間的差異進行物種鑒定[7]。該概念的提出受到了科學(xué)界的重視，因為它可準(zhǔn)確地將刺胞動物門（Cnidaria）外的共計11個門的13 320個個體逐一鑒別[8，9]。如同商品條形碼使用掃描儀就能識別條形碼信息一樣，將DNA條形碼與數(shù)據(jù)庫中已知的條形碼進行比對，即可鑒別出具體的類別。會議提出了國際DNA條形碼計劃（International barcode of life project，iBOL）。2004年在美國華盛頓國家自然歷史博物館創(chuàng)立了生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the barcode of life，CBOL）[10]。隨后10年，iBOL在世界各地舉辦了5次國際生命條形碼會議[11]。2005年2月，由CBOL和英國自然歷史博物館主辦的生命條形碼協(xié)會，在倫敦召開第一次國際會議，討論決定為1 000萬物種建立條形編碼庫[12]。2007年9月在臺北市召開了第二次國際會議，同年5月，加拿大圭爾夫大學(xué)（University of Guelph）成立世界上首個DNA條形碼鑒定中心，同時開始了生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)（Barcode of Life Data Systems，BOLD）的籌建工作。該系統(tǒng)將與NCBI、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)共享，整合已有物種的條形碼序列信息，建立一個全球共享的物種鑒定DNA條形碼系統(tǒng)[13]。2009年11月，在墨西哥召開第三次國際會議，CBOL 提出植物DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)片段將由rbcL和matK兩條基因共同使用來實現(xiàn)，同時不同類群的植物要求選配其他基因來提高物種的分辨率。2011年在澳大利亞舉行第四次國際DNA條形碼會議，專題討論了理想條形碼的選擇和確定問題[14]。2013年10月第五次國際DNA條形碼會議在中國昆明市舉辦，會議提出加強國際物種數(shù)據(jù)資源交流共享，建立統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和操作方法，推進DNA條形碼技術(shù)和生物多樣性科學(xué)發(fā)展，這5次會議對在全球推進DNA條形碼計劃起到了至關(guān)重要的作用。

隨著研究的開展，DNA條形碼在鳥類、魚類、節(jié)肢動物、軟體動物、基礎(chǔ)昆蟲學(xué)和應(yīng)用昆蟲學(xué)中都得到廣泛的應(yīng)用，甚至可以對同一物種的不同形態(tài)進行鑒別，例如不同發(fā)育階段、種群內(nèi)物種等級、復(fù)合物種等[8，15-17]。在植物研究方面，葉綠體基因片段rbcL和matK被確認作為植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的核心碼，葉綠體基因片段trnH-psbA和核基因片段ITS作為補充碼[18-20]。與動物、植物的DNA條形碼研究進展比較而言，菌物DNA條形碼技術(shù)的研究進展相對緩慢，目前仍處于尋找適合的目的基因片段并對其進行調(diào)試的階段。

2 ?DNA條形碼技術(shù)在真菌研究中的現(xiàn)狀

真菌是獨立存在的真核生物，該數(shù)量僅次于昆蟲，約有150萬種。Micheli（1972）在《植物新屬》中發(fā)表了真菌分屬檢索表并命名了他用顯微鏡觀察到的真菌Aspergillus Clathrus Geaster Mucor Polyporus和Tuber[21]。隨后，越來越多的真菌被發(fā)現(xiàn)，由于真菌形態(tài)簡單，有許多真菌難以通過離體培養(yǎng)方法獲得，部分真菌的離體培養(yǎng)物只有菌絲體，不產(chǎn)生有性或無性孢子，因此由形態(tài)特征進行菌種鑒定面臨著很大的挑戰(zhàn)，而以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的DNA條形碼技術(shù)對真菌物種的檢測與鑒定具有更重大的意義和應(yīng)用前景。為此，iBOL特別成立了真菌獨立工作組，并建立了國際真菌條形碼專業(yè)委員會（International Subcommission on Fungal Barcoding），負責(zé)iBOL計劃中與真菌有關(guān)的研究工作[22]。DNA條形碼的核心問題是標(biāo)準(zhǔn)片段的確定，人們最先將焦點放在對真菌中單一片段的篩選研究，涉及了細胞色素C氧化酶第一亞基COI和第二亞基CO基因核糖體基因中的ITS序列。隨后β-tubulin、ND6、LUS、SSU等基因紛紛被發(fā)掘作為真菌鑒定的DNA條形碼。

2.1 ?DNA條形碼COI

COI作為最早被提出的生物DNA條形碼，成功地在魚類、昆蟲上運用，所以真菌學(xué)家也對其在真菌中進行了大量的試驗。Seifert等[23]利用青霉屬Penicillium Link的58個種和12個近緣種為材料進行研究，結(jié)果表明，COI片段的種內(nèi)基因序列平均變異率小于ITS和微管蛋白（β-tubulin），為0.06%，種間平均變異率為5.6%;使青霉亞屬的物種分辨率達到66%，優(yōu)于ITS（-25%），但小于β-tubulin（-80%）基本可以選作青霉亞屬物種的DNA條形碼的基礎(chǔ)序列。以此為基礎(chǔ)，Chen等[24]以COI為條形碼技術(shù)，成功對70份環(huán)境樣品中青霉屬物種進行鑒定。Nguyen等[25]對分別來自美國和南非的Leohumicola N.L. Nickerson，Hambleton和Seifert屬下面的3個新種進行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)COI與ITS 片段具有相同的效果。然而，Geiser等[26]通過對56種真菌和卵菌的COI基因分析，發(fā)現(xiàn)在真菌界的壺菌門Chytridiomycota、接合菌門Zygomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota的絕大多數(shù)類群中都含有長度（134bp～3.1kb）和數(shù)量（1～7）不等的內(nèi)含子，由于內(nèi)含子的存在，使得已有的序列中由于缺少保守區(qū)而影響引物的設(shè)計，并干擾PCR擴增，COI不適合作為這些菌類的DNA條形碼;Gilmore等[27]以鐮刀菌屬Fusarium為材料進行研究得到的結(jié)果一致，內(nèi)含子出現(xiàn)在目標(biāo)條形碼的中間增加了目的片段序列的擴增難度，COI基因很難成為該類群的DNA條形碼。因此，在篩選特定真菌類群的DNA條形碼候選基因時，應(yīng)排除內(nèi)含子的區(qū)域干擾。而同樣的COI條形碼，在卵菌綱 Oomycetes中，因為沒有內(nèi)含子干擾，可以有效地鑒別出不同物種，因此 COI 基因可以成為卵菌類群中理想的DNA條形碼[28-30]。因此，COI在真菌某些屬種中具有很好的條形碼功能，而很多屬種由于COI基因的變異度太大，內(nèi)含子太多，而導(dǎo)致COI的使用受到限制。

2.2 ?DNA條形碼ITS

經(jīng)過多年研究的積累，NCBI上保存了接近172萬條ITS全長序列，其中56%序列標(biāo)有拉丁命名，涵蓋15 000個種，2 500個屬[31]。White等擴增真菌核內(nèi)核糖體RNA基因時首先設(shè)計ITS引物，隨后ITS序列分析技術(shù)常被用作真菌的遺傳距離的測定[32]，另外許多真菌類群的系統(tǒng)發(fā)育也利用ITS序列來計算[33]。許多真菌學(xué)家在嘗試COI的同時，提出ITS也是非常符合的基礎(chǔ)序列，并在很多種屬上進行驗證。接合菌方面，Schwarz等[34]分析了毛霉目Mucorales中16個種（54株菌）的ITS序列，結(jié)果表明除近緣種外ITS可以將其他種類區(qū)分開。擔(dān)子菌方面，ITS可以準(zhǔn)確地區(qū)分歐洲的鵝膏屬Amanita Dill. ex Boehm.的36個種[35，36]和絲膜菌Cortinarius ser. Callochroi Bidaud，Moinne-Locc.和Reumaux組的79 個種[37];銹菌方面，ITS可以較為準(zhǔn)確地區(qū)分開Chrysomyxa Unger屬（10種）的90%和Melampsora Castagne屬（5種）的80%種類[31]。而在地衣型子囊菌方面，96.3% 的標(biāo)本可以通過ITS準(zhǔn)確鑒定到種[38]。此外，ITS 可作為外生菌根真菌DNA條形碼，通過傳統(tǒng)和高通量的DNA測序技術(shù)，可以準(zhǔn)確應(yīng)用在外生菌根真菌物種多樣性的檢測與鑒定中[39-41]。同時對不產(chǎn)孢內(nèi)生真菌的鑒定，常規(guī)的形態(tài)鑒定以無性孢子及其產(chǎn)孢方式為依據(jù)進行，但是難度大、準(zhǔn)確性不高，經(jīng)過真菌ITS 序列種間變異率分析，大家普遍接受種間序列閥值為97% 的相似性[42，43]。利用ITS 條形碼通過DNA克隆和高通量測序技術(shù)可直接檢測與鑒定植物體內(nèi)內(nèi)生真菌的物種多樣性[44，45]。ITS在真菌分類上起到非常重要的作用，并且由于其自身的序列小、種間變異率小、使用范圍廣等特點，在2011年第四屆國際生命條形碼大會上正式推薦為真菌的首選DNA條形碼。隨后，2012年12月在美國舉辦的真菌研討會上，進一步確定了ITS作為真菌DNA條形碼的研究任務(wù)，完善真菌ITS數(shù)據(jù)庫的建設(shè)和數(shù)據(jù)整合[46]，這對推動真菌DNA條形碼研究與應(yīng)用具有里程碑意義。

2.3 ?其他新型真菌DNA條形碼

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，加之人們對于越來越多的真菌全基因組的認識，條形碼的選取已不僅僅局限于常用的COI和ITS片段，一些新的條形碼也在不斷地被嘗試和研究。

蛋白編碼基因β-tubulin也被證實是一種有效的真菌DNA條形碼，尤其是在子囊菌類β-tubulin 的分類效果要遠遠好于核糖體RNA基因[47]。Samson等[48]通過青霉亞屬的180株菌株的β-tubulin序列分析，證實β-tubulin 基因是一種理想的物種標(biāo)記。Zampieri等[49]成功運用β-tubulin 基因鑒定了塊菌屬 Tuber P. Micheli ex F.H. Wigg.，并將β-tubulin開發(fā)成土壤塊菌多樣性監(jiān)測的DNA條形碼。在子囊菌亞門曲霉屬中，β-tubulin被認為需要聯(lián)合CAL（鈣調(diào)蛋白）一起使用才是分辨率最好的 DNA條形碼[50]。然而，β-tubulin在地衣型真菌梅衣科Parmeliaceae和糞殼菌綱Sordariomycetes的類群分辨率極低，不能作為此類真菌的DNA條形碼[51，52]。因此，β-tubulin基因也只能作為真菌中部分種屬的DNA條形碼。

Santamaria等[53]研究子囊菌的線粒體基因，發(fā)現(xiàn)不含內(nèi)含子的特定區(qū)域包括完整的NADH脫氫酶亞基6（ND6）基因，此基因可為該菌群的DNA條形碼。Robert等[54]、Lewis等[55]通過分析不同菌種的基因組，從中發(fā)現(xiàn)新的條形碼序列 RPB2和EF1。核糖體大亞基（LUS）與ITS同為核糖體內(nèi)序列，因ITS的廣泛使用而被關(guān)注。目前在酵母菌屬被確定為基礎(chǔ)序列條形碼，同時在球囊菌門也有著很好分辨率[56]。在口蘑屬方面，研究表明小核糖體亞基（SSU）中的V6和V9片段，有著較好的分辨率，同時V9片段也可以作為擔(dān)子菌的條形碼[57]。Hajibabaei等[58]提出微型DNA條形碼的概念，由于常用的條形碼的序列都有500 bp以上，在鮮活的樣品中很容易獲得，然而在很多加工和腐爛的樣品中，很難獲得完整的條形碼序列，利用只有25 bp左右的微型條形碼就能解決這一問題。這一概念的提出，很多科學(xué)家通過大量的分析獲得了一些可以使用的微型DNA條形碼。

曾昭清等[59]以叢赤殼科13個屬中的34個種為材料研究4種蛋白編碼基因（Hsp90、AAC、CDC48和EF3）。結(jié)果表明，Hsp90和AAC基因雖然具有較高的PCR擴增與測序成功率，但種內(nèi)、種間距離頻率分布存在重疊，可能導(dǎo)致部分種的鑒定錯誤;CDC48基因可以恰當(dāng)?shù)貐^(qū)分種內(nèi)與種間差異，但擴增與測序成功率相對較低;EF3基因的最大種內(nèi)距離為1.79%，最小種間距離為3.19%，不存在種內(nèi)、種間距離重疊，并具有較高的PCR擴增與測序成功率（96.3%），適合作為該科真菌的DNA條形碼。

由于18S和28S基因過于保守，比ITS等基因的變異率低很多，不能適用大多數(shù)真菌類群的鑒定，目前只有異源細胞核復(fù)雜的球囊菌門利用它們作為DNA條形碼[60]。翻譯延伸因子而EF1-α標(biāo)記在鐮刀菌屬中鑒定分辨率比ITS更高[61]，但在大部分真菌中擴增成功率太低而無法勝任真菌條形碼。

越來越多的真菌DNA條形碼被挖掘出來，但是目前仍沒有一個能夠達到ITS序列那樣適用范圍廣、放大效果強的DNA條形碼。因此，很多科學(xué)家都是在以ITS序列為基礎(chǔ)條形碼上，針對某些特殊的種屬開發(fā)分辨率更加精細的DNA條形碼。

3 ?存在的問題及展望

目前DNA條形碼在真菌上的應(yīng)用存在的問題：①很難找到有絕對適應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)條形碼，真菌的種屬差異很大，總數(shù)龐大，基因序列的變異度大，很多通用的DNA條形碼序列，被多個內(nèi)含子干擾，給分子系統(tǒng)學(xué)鑒定帶來了更多不確定的因素。②由于真菌類群龐大，類群分離鑒定存在很大的困難，目前每個屬種都是用部分具有代表性的菌株進行相關(guān)鑒定，獲得效果很好的DNA條形碼，擴大范圍使用的時候效果也不是很好。因此更加系統(tǒng)地研究真菌的DNA條形碼才更有說服力。③DNA條形碼的數(shù)據(jù)日益增多，國際上缺乏統(tǒng)一的數(shù)據(jù)系統(tǒng)和計算標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致物種鑒定時由于不同物種的變異范圍不同，DNA條形碼的計算標(biāo)準(zhǔn)也各不相同。

全球約有150萬多種真菌，能命名的卻只有10萬種左右，巨大的鑒定工作，迫使人們努力地尋求新型快捷的鑒定技術(shù)。DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)無疑是給物種鑒定工作帶來了曙光，極大地加快了物種鑒定的步伐。中國具有豐富真菌資源，尤其是熱帶亞熱帶地區(qū)更是全球矚目的真菌生物多樣性熱點地區(qū)之一。大量的真菌材料需要人們進一步深入研究，結(jié)合目前的研究進展，要找到一段適合所有真菌的標(biāo)準(zhǔn)條形碼難度很大，但是通過幾個條形碼的組合來逐漸縮小鑒定范圍，對物種進行自動鑒定是可行的。尤其是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，大量的真菌全基因組數(shù)據(jù)涌現(xiàn)，加速了真菌DNA條形碼數(shù)據(jù)的積累，為真菌DNA條形碼的應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支撐。更加快速、簡便的真菌DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用，將在如下領(lǐng)域發(fā)揮作用：①大量真菌菌株的篩選工作，加速新物種的發(fā)現(xiàn);②為進出口病原菌檢疫、生物安全檢驗提供可靠、快速的技術(shù)支撐;③為食品安全中病原菌監(jiān)測提供靈敏、快速的監(jiān)測方法;④全面、準(zhǔn)確、快速地進行環(huán)境真菌多樣性檢測，實現(xiàn)區(qū)域性、全球性真菌多樣性環(huán)境監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。因此，DNA條形碼技術(shù)的成熟利用和廣泛推廣，將在真菌資源、生物安全、食品安全、生態(tài)環(huán)境等領(lǐng)域起到更加重要的作用。

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