轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β對(duì)A431細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)分子表達(dá)的影響

郭圓圓 彭斌 向桂瓊 耿松梅

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β對(duì)A431細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)分子表達(dá)的影響

郭圓圓 彭斌 向桂瓊 耿松梅

目的研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)對(duì)人表皮鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)相關(guān)分子表達(dá)的影響。方法用含7.5 μg/L TGF-β處理A431細(xì)胞72 h后觀察細(xì)胞形態(tài),采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)EMT相關(guān)基因E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)水平的變化。未經(jīng)TGF-β處理的A431細(xì)胞為對(duì)照組。結(jié)果TGF-β處理后,A431細(xì)胞獨(dú)立分散,呈梭形。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,E鈣黏著蛋白表達(dá)量為未經(jīng)TGF-β處理組的31.7%,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)量分別為未經(jīng)處理組的2.475、11.340、2.615倍;Western印跡結(jié)果,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)量上升,E鈣黏著蛋白表達(dá)量下降。結(jié)論TGF-β可誘導(dǎo)A431細(xì)胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象,TGF-β表達(dá)量上升,可能參與表皮鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞系,腫瘤;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞在一定條件下,以一定的順序丟失極性,失去細(xì)胞之間的緊密連接及黏附連接,在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞樣,并通過(guò)蛋白酶破壞基底膜,從而獲得侵襲性與游走能力的現(xiàn)象[1]。近年來(lái),EMT現(xiàn)象在大腸癌[2]、乳腺癌[3-4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起到的作用已得到證實(shí),而鱗狀細(xì)胞癌(SCC)為我國(guó)最常見(jiàn)的表皮腫瘤,較易發(fā)生轉(zhuǎn)移,其侵襲和轉(zhuǎn)移是否與EMT相關(guān)至今鮮有研究。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一組新發(fā)現(xiàn)的可由機(jī)體多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子,一般在分化活躍的細(xì)胞表達(dá)量較高,如腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、胚胎的造血細(xì)胞等[6-7],被認(rèn)為可能與EMT的發(fā)生相關(guān)[8]。那么,TGF-β是否可以誘導(dǎo)人表皮SCC A431細(xì)胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象并使其具有更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力呢?為此,我們觀察TGF-β處理A431細(xì)胞后的形態(tài),并采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡技術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)EMT相關(guān)基因E鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β聯(lián)蛋白(βcatenin)在TGF-β處理的A431細(xì)胞中的表達(dá)水平。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞來(lái)源:人表皮SCC A431細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2.主要試劑:重組人TGF-β(美國(guó)Peprotech公司),胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司),胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司),鼠抗人E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白、β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),山羊抗鼠二抗(美國(guó)Abcam公司),放射免疫共沉淀(RIPA)裂解液(美國(guó)Roche公司),RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),Perfect Real Time試劑盒(日本TaKaRa公司)。

3.主要儀器:JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀(上海培清科技公司),SP-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Eppendorf公司),實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):A431細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中以5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng),隔天換液。

2.藥物干預(yù):加藥組:選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A431細(xì)胞饑餓過(guò)夜,用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋TGF-β原液至7.5 μg/L[9],培養(yǎng)A431細(xì)胞72 h。對(duì)照組:用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)同代細(xì)胞72 h。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察加藥組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間連接情況等,并拍照。

3.實(shí)時(shí)定量PCR:參照總RNA極速抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取加藥組與對(duì)照組細(xì)胞總RNA,并采用SP-1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值,以判定RNA純度。參照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明,采用10 μl反應(yīng)體系,按37℃ 15 min,85℃ 5 s條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),所得產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)定量PCR。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)基因序列,實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成(表1)。20 μl反應(yīng)體系內(nèi)含有cDNA模板 2 μl,2 × SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROX Reference Dye 0.4 μl,上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,DEPC水6 μl。擴(kuò)增條件為第1步95℃ 30 s,第2步95℃5 s、60℃31 s,共重復(fù)40個(gè)循環(huán),第3步95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。 以 2-ΔΔCt表示加藥組與對(duì)照組目的mRNA表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系。公式如下:ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]加藥組 -[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]對(duì)照組。

4.Western印跡檢測(cè)E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白的表達(dá):參照RIPA裂解液說(shuō)明書(shū)分別提取加藥組與對(duì)照組細(xì)胞總蛋白,并采用SP-1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值,驗(yàn)證蛋白純度。在蛋白內(nèi)加入少量上樣緩沖液,煮沸5 min。將蛋白以10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(SDS-PAGE),分別切下目的蛋白質(zhì)所在位置凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將硝酸纖維素濾膜放入含吐溫Tris緩沖生理氯化鈉溶液(TBST)配制的5%脫脂奶粉封閉液中,37℃溫育2 h,硝酸纖維素濾膜與相應(yīng)鼠抗人一抗抗體工作液共同4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜液漂洗3次,二抗孵育1 h,TBST洗膜液漂洗3次,加入發(fā)光劑,于自動(dòng)凝膠圖像分析儀下調(diào)節(jié)發(fā)光時(shí)間并拍照。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

結(jié) 果

一、TGF-β處理對(duì)A431細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置光學(xué)顯微鏡下觀察:以不含TGF-β的無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的A431細(xì)胞整體輪廓呈鋪路石樣,聚集呈團(tuán)塊狀,細(xì)胞呈鵝卵石形或多角形,胞質(zhì)透亮(圖1a);在含7.5 μg/L TGF-β的無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后,可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞獨(dú)立不融合(圖1b)。

二、TGF-β處理對(duì)A431細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

利用上述E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白及GADPH引物擴(kuò)增的基因片段,其熔解曲線具有擴(kuò)增的一致性,PCR擴(kuò)增呈指數(shù)生長(zhǎng)且具有平臺(tái)期。加藥組E鈣黏著蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的31.7%,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.475、11.340、2.615倍。

三、TGF-β處理對(duì)A431細(xì)胞EMT相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)檢測(cè)N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)量上升,E鈣黏著蛋白表達(dá)量下降,與mRNA表達(dá)量變化一致(圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β處理A431細(xì)胞前后細(xì)胞形態(tài)比較(×400) 1a:對(duì)照組,細(xì)胞呈鵝卵石樣,團(tuán)塊狀分布;1b:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β處理組,細(xì)胞呈梭形,分散呈單個(gè)分布

圖2 Western印跡檢測(cè)A431細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因蛋白表達(dá) 1:對(duì)照組;2:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β處理組

討 論

最初,人們發(fā)現(xiàn)EMT現(xiàn)象時(shí),認(rèn)為它是胚胎發(fā)育過(guò)程中胚胎發(fā)生形態(tài)學(xué)變化的重要因素[7]。然而,隨著對(duì)EMT現(xiàn)象研究的深入,人們?cè)絹?lái)越關(guān)注EMT現(xiàn)象在早期腫瘤向侵襲性腫瘤及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到的作用[10-12]。EMT現(xiàn)象的發(fā)生總是伴隨著上皮相關(guān)的基因水平下調(diào)及間質(zhì)相關(guān)的基因水平上調(diào)。如參與上皮細(xì)胞間的黏附連接并維持上皮細(xì)胞極性的E鈣黏著蛋白的下調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞特異性的波形蛋白、N鈣黏著蛋白的表達(dá)上調(diào)等[13]。而在腫瘤團(tuán)塊中,這些基因的表達(dá)改變,引起腫瘤細(xì)胞間緊密連接及黏附連接丟失、細(xì)胞骨架破壞,導(dǎo)致細(xì)胞頂端變窄、基底膜帶結(jié)構(gòu)紊亂,使腫瘤細(xì)胞溢出基底膜帶向周圍遷徙并進(jìn)入血管、淋巴管等發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。

有研究表明,上皮樣腫瘤細(xì)胞表達(dá)E鈣黏著蛋白,不具有穿透Marigel(一種包含膠原、蛋白多糖、細(xì)胞因子及多種酶類并模仿機(jī)體細(xì)胞膜的物質(zhì))的能力;而纖維細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞E鈣黏著蛋白表達(dá)量低,可以穿透Marigel,將E鈣黏著蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染到此類細(xì)胞中,其侵襲能力受到抑制。說(shuō)明纖維細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞可能是由上皮樣腫瘤細(xì)胞E鈣黏著蛋白表達(dá)量下降轉(zhuǎn)化而來(lái)[10]。如果發(fā)現(xiàn)了刺激這種轉(zhuǎn)化的因素,有可能推斷腫瘤惡性程度升高的原因。

近來(lái)研究提出,當(dāng)機(jī)體受到TGF-β刺激后,可能可以通過(guò)TGF-β-Smad信號(hào)通路及TGF-β-non-Smad信號(hào)通路誘發(fā)EMT現(xiàn)象,進(jìn)而引起ZO-1、波形蛋白等表達(dá)上調(diào),E鈣黏著蛋白等表達(dá)下調(diào)等,從而使上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞間的黏附能力下降,造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。

本課題組利用人表皮SCC細(xì)胞系A(chǔ)431細(xì)胞,觀察TGF-β處理組細(xì)胞與未經(jīng)TGF-β處理組細(xì)胞的形態(tài)變化及EMT相關(guān)基因表達(dá)的變化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β處理,A431細(xì)胞在形態(tài)上向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞間隙增寬,在mRNA及蛋白水平上發(fā)生E鈣黏著蛋白表達(dá)量下降,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達(dá)量上升現(xiàn)象,符合發(fā)生EMT現(xiàn)象的變化。推測(cè)TGF-β的確是刺激人表皮鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞內(nèi)在構(gòu)成性信號(hào)通路發(fā)生變化,發(fā)生EMT現(xiàn)象,從而使其具有更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。抑制TGF-β與其受體的結(jié)合為降低SCC的惡性程度提供了一種新的思路。

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2013-09-04)

(本文編輯:尚淑賢)

Effects of transforming growth factor-β on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition-related molecules in A431 cells

Guo Yuanyuan,Peng Bin,Xiang Guiqiong,Geng Songmei.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China

Geng Songmei,Email:gsm312@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effect of transforming growth factor-β(TGF-β)on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)-related molecules in human A431 epidermal squamous cell carcinoma cells.MethodsCultured A431 cells were classified into two groups:TGF-β group treated with TGF-β of 7.5 μg/L for 72 hours,and control group remaining untreated.Subsequently,cell morphology was observed under an inverted microscope,and real time-PCR and Western blot were performed to quantify the mRNA and protein expressions of EMT-related molecules including E-cadherin,N-cadherin,vimentin and β-catenin respectively.ResultsAfter TGF-β treatment,the cells became dispersed and spindle in shape.The mRNA expression levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,and β-catenin in TGF-β group were 0.317,2.475,11.340 and 2.615 folds those in the control group respectively.Western blot showed a marked increase in the expression of N-cadherin,vimentin,and β-catenin proteins but a notable decrease in that of E-cadherin in the TGF-β group compared with the control group.ConclusionsTGF-β can induce EMT in A431 cells,and increased expression of TGF-β may contribute to the invasion and metastasis of SCC.

Cell line,tumor;Transforming growth factor beta;Epithelial-to-mesenchymal transition

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.010

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81372912);教育部新世紀(jì)人才支持計(jì)劃(NCET-10-0673);西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院基金[YJ(ZD)201219]

710004西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科

耿松梅,Email:gsm312@yahoo.com