黨參水提物對D－半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結構的影響*

耿廣琴，楊雅麗，王 晶，黃 勇

(甘肅中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，甘肅蘭州730000)

衰老是一個復雜的多環(huán)節(jié)生物學過程，是生物界普遍存在的一種自然現(xiàn)象，是一切多細胞生物隨著時間的推移而表現(xiàn)出的各個細胞和器官功能的不可逆地、全面地、逐漸地喪失［1］。衰老雖不可逆轉，但可以緩解［2］。當今世界人口老齡化問題日趨嚴重，我國老齡化問題尤為嚴峻。面對衰老帶來的諸多社會、生活問題，開展老年醫(yī)學及老年生物學方面的研究，探討延緩衰老的方法，成為當前醫(yī)學界的研究熱點之一。甘肅道地中草藥黨參具有補中、益氣、生津之功效。研究報道顯示:注射或服用黨參水提物可以增強體質，提高人體免疫力，延緩衰老［3－4］。本實驗以D－半乳糖建立致衰老小鼠模型，研究黨參水提物對衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量和超微結構的影響，旨在探討中藥黨參保肝護腎抗衰老的機制，以使其更好地發(fā)揮藥用價值，同時為中醫(yī)藥延緩衰老機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

PF級昆明種小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質量(18±2)g，購自甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心，合格證號:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經甘肅中醫(yī)學院中藥學教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過濾后，濃縮成含生藥0.5 g/mL的水煎劑，置4℃冰箱備用，水煎液每5 d制備1次。D－半乳糖，美國Sigma公司產品，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L，備用;考馬斯亮藍測定試劑盒(批號20130819)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20130726)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20130726)，均購自南京建成生物工程研究所。BS224S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產品;XYJ80－20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實業(yè)有限公司產品;VIS－723N型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司產品;JEOL－1230透射電子顯微鏡，日本電子公司產品。

1.3 動物分組及模型的建立

將100只小鼠，隨機分為正常對照組、模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對照組、黨參水提物各劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質量分數(shù)50 g/L的 D－半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g，正常對照組注射等體積量生理鹽水。采用灌胃給藥法，黨參水提物低、中、高劑量組每日上午按相當于生藥量5，10，15 g/kg劑量給藥，正常對照組、模型對照組灌服等體積生理鹽水，與造模同步，連續(xù)42 d。

1.4 檢測指標

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質量;斷頭處死小鼠，迅速剖取胸腺、脾、肝、腎，用預冷的4℃生理鹽水洗凈表面殘血，備用。

1.4.1 胸腺、脾臟指數(shù)

將胸腺、脾臟用濾紙吸干，電子天平稱量質量，臟器指數(shù)=內臟質量(mg)/體質量(g)。

1.4.2 SOD 活性、MDA 含量

分別取大鼠肝、腎組織塊約0.3 g，用預冷的生理鹽水制備成100 g/L的肝勻漿和腎勻漿，3 000 r/min離心5 min，上清液 －20℃凍存，用于SOD活性、MDA含量測定。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法(TBA)法，組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭法。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 超微結構觀察

取大鼠肝及腎皮質組織結構1 mm3，分別固定于1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制的30 g/L戊二醛固定液中2 h;PBS液漂洗3次，每次10 min;10 g/L鋨酸固定 1.5 h;PBS液漂洗 3次，每次10 min;500，700，800，900，1000 g/L 乙醇梯度脫水，每次10 min;純丙酮脫水2次，每次10 min;EPON-812環(huán)氧樹脂∶純丙酮(1∶1)浸透2 h;EPON-812環(huán)氧樹脂包埋;聚合(35℃ 24 h，45℃ 24 h，65℃24 h);半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位;超薄切片，透射電子顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤差(mean±SDs)表示，組間比較采用one-way ANOVA分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)對比

與正常對照組對比，模型對照組胸腺指數(shù)下降，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型對照組對比，黨參水提物3個劑量組胸腺指數(shù)增高，但差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與正常對照組對比，模型對照組脾臟指數(shù)降低，但差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與模型對照組對比，黨參水提物3個劑量組脾臟指數(shù)均升高，但差別均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)對比 mean±SDs

2.2 各組小鼠肝、腎SOD活力及MDA含量對比

正常對照組肝臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01)，黨參水提物低、中、高劑量組肝臟中SOD活性均高于模型對照組，其中高劑量組肝臟中SOD活性較之差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。正常對照組腎臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01);黨參水提物低、中、高劑量組腎臟中SOD活性均高于模型對照組，其中中、高劑量組腎臟中SOD活性較之差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與模型對照組小鼠對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、高劑量組較之差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠腎臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、黨參水提物中、高劑量組較之差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P ＜0.01)。見表2。

表2 各組小鼠肝、腎中SOD活力、MDA含量對比 mean±SDs

2.3 各組小鼠肝、腎超微結構對比

肝臟超微結構變化見圖1。正常對照組肝細胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，核周少量異染色質，胞質內細胞器豐富，粗面內質網、線粒體、核糖體等結構正常。模型對照組肝細胞核體積相對于正常略有縮小，核異染色質增多，胞質內局部細胞器線粒體、內質網數(shù)量明顯減少，殘留較多糖原顆粒，及少量脂滴，并可見部分胞質內線粒體腫脹。黨參水提物低劑量組肝細胞胞質內部分線粒體腫脹。黨參水提物中劑量組肝細胞核形態(tài)正常，胞質內線粒體結構正常，內質網輕中度擴張。黨參水提物高劑量組肝細胞結構正常。

腎臟超微結構變化見圖2。正常對照組腎近曲小管上皮細胞結構、胞質內線粒體正常，游離面致密，微絨毛結構排列整齊。模型對照組腎小管上皮細胞胞質內線粒體腫脹、體積增大，線粒體嵴溶解，減少。黨參水提物低劑量組腎小管上皮細胞胞質細胞器腫脹，游離面微絨毛稀疏、脫落或完全消失。黨參水提物中劑量組腎小球內部分毛細血管節(jié)段系膜細胞、系膜基質輕度增生，但程度明顯輕于模型對照組，足細胞足突結構基本正常。黨參水提物高劑量組大部分腎小管上皮細胞胞質內細胞器結構正常，僅見少量線粒體腫脹。

圖1 各組小鼠肝臟超微結構(×10 000)

圖2 各組小鼠腎臟超微結構(×10 000)

3 討論

中醫(yī)學認為:衰老是整體性的、退行性的變化過程，而五臟虛損是衰老整體變化中的核心部分。隨著年齡增長，機體五臟逐漸虛損，最終五臟皆虛，而盡終其天年。五臟虛損不僅是衰老的特征表現(xiàn)，也是導致衰老的重要原因［5］。五臟之中，腎與衰老的關系最為密切［6］，肝與衰老的關系也非常明朗［7］?！澳I元盛則壽延，腎元衰則壽夭”(《醫(yī)學正傳》)，人體衰老與否，以及衰老的速度、衰老的程度、壽命的長短主要取決于腎氣的強弱。肝與衰老的關系始載于《靈樞·天年》，曰:“五十歲，肝氣始衰，肝葉始薄，膽汁始滅，目始不明……”此明確提出了肝在衰老過程中居于先導地位［8］。本研究結果顯示:模型對照組肝、腎中SOD活性明顯下降，MDA含量升高，胸腺指數(shù)下降，符合衰老的一些病理學特征［9－10］，表明本實驗衰老模型的建立是成功的。給予動物模型黨參水提物后，可阻止衰老的發(fā)展，其中黨參水提物高劑量組諸指標基本恢復或接近正常水平，表明:黨參可以通過提高肝、腎SOD活性，顯著降低體內MDA含量，減輕脂質過氧化對機體造成的損傷，對延緩衰老能起到了積極作用。

電鏡觀察結果表明:與正常對照組對比，模型對照組肝臟超微結構出現(xiàn)了明顯異常改變，主要表現(xiàn)為細胞核體積相對縮小，胞質內線粒體腫脹，線粒體、內質網數(shù)量明顯減少。給予黨參水提物后，中劑量組肝臟超微結構明顯改善，高劑量組肝細胞結構恢復正常。與正常對照組對比，模型對照組腎小管上皮細胞胞質內線粒體腫脹，嵴溶解、減少。給予黨參水提物后，中、高劑量組腎臟超微結構的異常變化明顯緩解。線粒體是細胞內能量合成的主要場所，內質網是蛋白質的合成與加工的部位，細胞作為生物體結構與功能的基本單位，只有保持其完整性，才能正常完成各項生命活動?？梢婞h參可以抑制衰老導致的小鼠肝、腎組織超微結構的異常變化，對維持細胞結構的完整性、維持細胞正常生理功能起到了重要的作用。從衰老致小鼠肝、腎超微結構的變化程度來看，腎臟的損傷程度明顯大于肝臟的損傷程度、這與肝、腎中SOD活性、MDA含量的變化一致，這或許是因為，相對于腎臟，肝臟自我修復和代償能力較強。

綜上所述，黨參水提物可增強機體的抗氧化能力，減輕脂質過氧化對機體造成的損傷，延緩肝、腎細胞超微結構變化，具有保肝護腎，減慢衰老進程的作用，其中高劑量的效果更為理想。

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