三葉蔓荊提取物對(duì)幾種害蟲的生物活性研究

高 燕，陳 婷，齊國(guó)君，于永浩

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007)

三葉蔓荊Vitex trifolia L.為馬鞭草科牡荊屬植物，是多年生落葉小灌木，在我國(guó)主要分布于福建、山東、江西、浙江、廣東、廣西及云南等地(張麗梅等，2007)。其干燥成熟果實(shí)稱之為蔓荊子，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目等功效，在臨床應(yīng)用較廣(國(guó)家藥典委員會(huì)，2010)。研究表明，蔓荊子中含有多種揮發(fā)油，主要含有黃酮、苷類、萜類等成分(閆利華等，2009，2010)。目前對(duì)三葉蔓荊主要作為藥用植物和防風(fēng)固沙植物進(jìn)行研究與開發(fā) (左長(zhǎng)清等，2003)。三葉蔓荊的莖、葉、果實(shí)都能入藥，有消炎止痛的功效，用于外感頭痛、眩暈、目痛、跌打損失、風(fēng)濕疼痛等多種疾病的治療(里二等，2010)。近年來發(fā)現(xiàn)，三葉蔓荊除具有較強(qiáng)的藥理活性外，還具有殺蟲活性。三葉蔓荊粗提物對(duì)草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda 和小菜蛾P(guān)lutella xylostella 具有拒食活性(Hernández et al.，1999;高燕等，2012)，對(duì)塵污燈蛾Spilosoma oblique Walker 幼蟲具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用(Shishir et al.，2008)，對(duì)棉蚜Aphis gossypii Glover (Devi et al.，2003)、致倦庫(kù) Culex quinquefasciatus 和伊蚊Aedes aegypti 幼蟲具有毒殺活性(Kannathasan et al.，2008，2011)等。另外，三葉蔓荊對(duì)水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、鐮刀菌Fusarium sp.、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea 等具有不同程度的抑菌活性 (Ansari 1995;Hernández et al.，1999;朱立成等，2007)。為了系統(tǒng)評(píng)價(jià)三葉蔓荊在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用前景，本文采用不同的生物活性測(cè)定方法，研究了三葉蔓荊對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食、對(duì)菜粉蝶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育抑制以及對(duì)家蠅的毒殺活性，以期為開發(fā)三葉蔓荊植物源農(nóng)藥及復(fù)配農(nóng)藥提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

三葉蔓荊采自云南省德宏州。蔓荊葉片自然陰干后粉碎，過60 目篩。

1.2 供試?yán)ハx

甘藍(lán)蚜Brevicoryne brassicae L.和菜粉蝶Pieris rapae L.幼蟲:個(gè)體一致的室內(nèi)盆栽甘藍(lán)苗上長(zhǎng)期飼養(yǎng)，未接觸過藥劑。

家蠅Musca domestica:采用人工飼料于光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)的敏感品系，溫度為25± 1℃、RH(80±5)%、光周期L∶D=14∶10。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

稱取50 g 干粉放入1000 mL 三角瓶中，加入500 mL 有機(jī)溶劑(分別為石油醚、氯仿、乙酸乙酯和乙醇)室溫下靜置8 小時(shí)，再經(jīng)超聲波提取30 min，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得不同溶劑膏狀提取物，如此重復(fù)3 次，稱重，保存于4℃冰箱中備用。

1.3.2 生物活性測(cè)定方法

1.3.2.1 對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食作用 (張鐘寧等，1993)

將供試樣品用95%的乙醇配制成一定質(zhì)量濃度的藥液。用與提取物等體積的95%乙醇作為對(duì)照，取未受污染、新鮮干凈的甘藍(lán)葉片，制成直徑為9 cm 的葉碟。以葉碟中間葉脈為界，用毛筆將配好的藥液均勻涂于葉背面一側(cè)，另一側(cè)涂95%乙醇作為對(duì)照，自然條件下晾干。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中添加一定量的蒸餾水保濕，將處理葉片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，然后將蚜蟲接到葉碟中部，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于室溫下(23±2)℃觀察。挑選大小一致的無翅蚜進(jìn)行生物測(cè)定。每處理蚜蟲120 頭，重復(fù)4 次。分別于處理24 h、48 h 后統(tǒng)計(jì)對(duì)照和處理的蚜蟲棲息量，根據(jù)下式計(jì)算拒食率:

1.3.2.2 對(duì)菜粉蝶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育抑制活性的測(cè)定

用浸漬葉碟飼喂法測(cè)定提取物對(duì)菜粉蝶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響。帶藥葉碟制作同1.3.2.1。挑選大小一致、饑餓4 h 的5 齡菜粉蝶幼蟲，每皿內(nèi)放置3 頭。不間斷用帶藥葉碟飼喂，供試幼蟲在溫度27±1℃、RH (80±5)%、光周期L∶D=14∶10 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)下飼養(yǎng)。每處理蟲數(shù)30 頭，重復(fù)4 次。處理前稱試蟲體重，處理后每隔24 h 稱一次試蟲體重。觀察記錄試蟲的取食、化蛹情況。根據(jù)下式計(jì)算幼蟲體重增長(zhǎng)抑制率:

1.3.2.3 對(duì)家蠅幼蟲的毒殺作用

參照駱焱平等(2008)方法加以改進(jìn)。以2齡家蠅幼蟲為試蟲，采用浸漬法進(jìn)行測(cè)定。將各提取物用蒸餾水稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL 5 個(gè)濃度梯度，把蟲齡一致的家蠅幼蟲分別放進(jìn)裝有不同濃度藥液的燒杯中，浸泡1 h，然后用清水洗凈蟲體表面的殘液，轉(zhuǎn)移到含新鮮飼料的500 mL 三角瓶中，杯口用紗布密封，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度27℃±1℃，相對(duì)濕度75%-85%，L∶D=14∶10)，對(duì)照用蒸餾水。每處理80 頭蟲，設(shè)4 個(gè)重復(fù)，于24 h、48 h 檢查試蟲死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS11.0 和EXCEL2003 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分組分析，數(shù)據(jù)之間的差異采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食作用

三葉蔓荊葉片的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和乙醇提取物對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食作用結(jié)果見表1。4種不同溶劑提取物在濃度為10 mg/mL 時(shí)，對(duì)甘藍(lán)蚜均有一定程度的拒食活性。其中乙酸乙酯的效果最好，24 h 和48 h 的拒食率分別為88.89% 和86.36%;石油醚提取物的拒食率分別為69.06%、55.58%;氯仿和乙醇提取物的效果較差。結(jié)果還表明，4種提取物24 h 對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食活性均高于48 h。

表1 三葉蔓荊葉片提取物對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食作用Table 1 Antifeeding activity of extracts from Vitex trifolia leaves against Brevicoryne brassicae

2.2 提取物對(duì)菜粉蝶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的抑制

用濃度為10 mg/mL 不同溶劑提取物浸漬葉碟，連續(xù)飼喂5 齡菜粉蝶幼蟲，每日稱重，測(cè)定結(jié)果見表2。從表2 可以看出，第1 天各溶劑提取物處理的昆蟲體重之間有明顯差異，其中乙酸乙酯提取物平均體重最小，其次為石油醚提取物。第2 天各提取物體重變化趨勢(shì)和第一天相同。幼蟲從處理后第2 天開始陸續(xù)化蛹，第三天始平均體重下降。對(duì)照在第3 天達(dá)到化蛹高峰，乙酸乙酯和石油醚提取物處理組化蛹高峰在第5 天，乙醇和氯仿提取物組的化蛹高峰分別出現(xiàn)在第4 天、第5 天。通過計(jì)算得知，4種不同溶劑提取物對(duì)5齡菜粉蝶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育均有影響。其中乙酸乙酯提取物對(duì)幼蟲的影響最大，體重增長(zhǎng)抑制率第1天達(dá)75.35%，第2 天降為61.05%。石油醚提取物在第1 天抑制率為54.74%，第2 天降到39.52%。其它兩種提取物體重增長(zhǎng)抑制率較低。同時(shí)乙酸乙酯提取物處理組幼蟲的活動(dòng)能力較差，取食量較少。4種不同溶劑提取物處理的校正死亡率以乙酸乙酯提取物處理最高50.00%，其次是石油醚和氯仿 41.67%，乙醇提取物的最低為20.83%。

表2 三葉蔓荊葉片提取物對(duì)5 齡菜粉蝶幼蟲體重增長(zhǎng)的影響Table 2 Inhibiting effect of extracts from Vitex trifolia leaves to weight gain of Pieris rapae

2.3 提取物對(duì)家蠅幼蟲的毒殺作用

三葉蔓荊葉片不同溶劑提取物對(duì)家蠅幼蟲的毒殺結(jié)果見表3。從表3 可以看出，隨著處理濃度的增大，三葉蔓荊葉片不同溶劑提取物對(duì)家蠅幼蟲的毒殺死亡率隨之增大;另外，隨著處理時(shí)間的增加，家蠅2 齡幼蟲的死亡率也隨之增大。24 h結(jié)果可以看出，各提取物在50 mg/mL 的濃度下，乙酸乙酯提取物的校正死亡率最高為66.67%，其次是石油醚提取物的54.67%，其他兩種溶劑提取物的校正死亡率均低于50%。48 h 各處理各濃度的校正死亡率均較24 h 的校正死亡率有所提高，乙酸乙酯提取物最高為82.46%，石油醚為73.68%，氯仿和乙醇分別為68.42%和61.40%。

處理48 h 時(shí)計(jì)算三葉蔓荊葉片提取物對(duì)家蠅2齡幼蟲的殺蟲毒力方程，并計(jì)算LC50，結(jié)果見表4。可以看出，三葉蔓荊葉片不同溶劑提取物對(duì)家蠅2 齡幼蟲均具有毒殺效應(yīng)，在48h 時(shí)對(duì)家蠅幼蟲的致死中濃度在22.78-35.01 mg/mL。48 h 各溶劑提取物中的乙酸乙酯提取物的LC50最低為22.78 mg/mL，其次是石油醚、氯仿和乙醇;表明乙酸乙酯提取物對(duì)家蠅幼蟲觸殺效果較好。

表3 三葉蔓荊葉片提取物對(duì)家蠅2 齡幼蟲的毒殺作用的校正死亡率Table 3 Corrected mortality of contact effect of extracts from Vitex trifolia leaves to Musca domestica

表4 三葉蔓荊葉片提取物對(duì)家蠅2 齡幼蟲的毒殺效應(yīng)Table 4 Contact effect of extracts from Vitex trifolia leaves to Musca domestica

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食作用研究可以看出，三葉蔓荊葉片用不同溶劑進(jìn)行提取的提取物對(duì)甘藍(lán)蚜的拒食率明顯不同，其中乙酸乙酯提取物的效果最好。乙酸乙酯提取物對(duì)甘藍(lán)蚜具有顯著的拒食作用，且24 h 的拒食活性明顯大于48 h，這與三葉蔓荊葉片提取物對(duì)小菜蛾的拒食活性結(jié)果一致(高燕等，2012)，原因可能是有效成分不穩(wěn)定，持效期較短(秦小萍等，2008)。

三葉蔓荊葉片提取物對(duì)菜粉蝶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的抑制試驗(yàn)表明，幾種溶劑提取物對(duì)5 齡菜粉蝶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育均有不同程度的影響，其中以乙酸乙酯提取物和石油醚提取物效果較好。幼蟲取食處理過的葉碟后，活動(dòng)能力較差，取食量減少，在體重、化蛹等方面都有明顯的降低。校正死亡率以乙酸乙酯提取物處理最高50.00%，其次是石油醚和氯仿均為41.67%，差異不顯著。

對(duì)家蠅2 齡幼蟲的毒殺作用試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著處理濃度以及處理時(shí)間的增大，對(duì)家蠅幼蟲的觸殺死亡率逐漸增大。另外各溶劑提取物在高濃度下對(duì)家蠅幼蟲有一定的毒殺作用，低濃度下效果較差。48 h 的LC50，乙酸乙酯提取物最低為22.78 mg/mL，這個(gè)濃度遠(yuǎn)高于拒食和生長(zhǎng)發(fā)育抑制試驗(yàn)設(shè)定的濃度，說明三葉蔓荊對(duì)家蠅幼蟲的毒殺活性較低。

植物源農(nóng)藥因其低毒、環(huán)保、高效而備受人們關(guān)注，成為農(nóng)藥發(fā)展的一個(gè)新方向。本文對(duì)三葉蔓荊葉片提取物的殺蟲活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物拒食活性以及生長(zhǎng)發(fā)育抑制活性作用顯著，有必要開展進(jìn)一步研究。試驗(yàn)中的供試樣品質(zhì)量濃度為粗提取物質(zhì)量濃度，而植物中有效的殺蟲活性成分含量很低，若進(jìn)一步純化，其殺蟲活性可能會(huì)進(jìn)一步提高。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蔓荊子在農(nóng)業(yè)方面的研究應(yīng)用較少，且主要集中在粗提物和黃酮類成分的分離純化方面，而對(duì)特征性成分的生物活性研究不夠深入。蔓荊子在我國(guó)傳統(tǒng)中藥中具有悠久的應(yīng)用歷史，因此，有必要深入研究其有效成分、生物活性以及作用機(jī)理等，為該植物的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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