脂氧合酶OsRCI-1 正調(diào)控水稻對二化螟的抗性

姚張良 ，曹夢嬌，王 霞，繆家順，沈勵澤，鄧建宇，吳慧明，徐志宏，婁永根，周國鑫*

(1.浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院植物保護系，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術研究重點實驗室，浙江臨安，311300;2.浙江大學水稻生物學國家重點實驗室，昆蟲科學研究所，浙江杭州，310058)

植物脂氧合酶 LOXs (linoleate:oxygen oxidoreductase，EC1.13.11.12)將亞油酸(linoleic acid)和亞麻酸(linolenic acid)氧化成C-9 或C-13 氫過氧化物，這些物質(zhì)經(jīng)不同支路代謝生成一系列具有生物活性的脂氧化產(chǎn)物-脂氧合素(Oxylipins) (Wasternack and Hause，2013)。研究表明，植物脂氧合素(Oxylipins)在植物抵御非生物脅和生物脅迫的信號傳導中起關鍵作用，同時一些植物脂氧合素(Oxylipins)本身就是抗蟲防御化學物質(zhì)，此外Oxylipins 也在植物生長發(fā)育、器官形態(tài)建成、開花繁殖中具有重要作用(Demmig-Adams et al.，2013)。其中，茉莉酸(Jasmonic acid，JA) 和綠葉 氣味分 (Green leaf volatiles，GLVs)是近二十年來植物抗蟲防御反應中研究的較多、較深入的2種植物脂氧合素(Oxylipins)，這兩類物質(zhì)雖然其本身沒有殺蟲活性，但可作為信號分子誘導植物產(chǎn)生抗蟲免疫防御反應(Demmig-Adams et al.，2013)。研究表明，植物脂氧合酶(LOXs)是茉莉酸(JA)和綠葉性氣味分子(GLVs)生物合成途徑中的關鍵酶(Wasternack and Hause，2013)。

在植物中，脂氧合酶由一個基因家族編碼，家族中各LOX 基因表達模式、催化特性、生物學功能存在巨大差異。不同的LOX 基因催化產(chǎn)物往往只用于特定的代謝支路，如玉米ZmLOX8 和ZmLOX10 定位于不同的亞細胞器中，分別特異性地為茉莉酸 (JA)途徑和綠葉性氣味分子(GLVs)生物合成提供底物 (Christensen et al.，2013)。雖然4 個擬南芥13-LOX 基因AtLOX2、AtLOX3、AtLOX4 和AtLOX6 都參與機械損傷誘導的茉莉酸合成，但是只有AtLOX6 是擬南芥葉片應答遠距離機械損傷信號誘導早期茉莉酸積累所必須的(Chauvin et al.，2013)?？梢?，家族中各LOX基因編碼蛋白的生化活性、生物學功能存在巨大差異。

與擬南芥、煙草、玉米等相似，水稻脂氧合酶基因家族也由多個基因成員組成，水稻基因組至少存在15 個LOX 基因(Agrawal et al.，2004)。已有的研究表明，水稻LOX 基因成員的生物學功能存在多樣性，不同LOX 基因分別在糧食陳化、抗病蟲中起著重要作用。水稻種子中有3 個脂氧合酶同工酶sLOX-1、sLOX-2 和sLOX-3，缺失sLOX-1 或sLOX-2 的水稻種子陳化速度顯著減慢;缺失sLOX-3 水稻種子對陳化速度沒有影響，但是缺失sLOX-3 水稻不易吸引谷蠹Rhizopertha dominica 為害(Zhang et al.，2007)。

在水稻脂氧合酶基因調(diào)控水稻抗蟲誘導防御反應方面，Wang 等2008年報道OsLOX1 具有C9/13-LOX活性，參與水稻體內(nèi)茉莉酸(JA)和綠葉性氣味分子(GLVs)的生成，正調(diào)控對褐飛虱的抗性。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)OsHI-LOX 僅具有C13-LOX 活性，其參與蟲害誘導的茉莉酸(JA)合成，但不參與水稻綠葉性氣味(GLVs)的釋放(Zhou et al.，2009)。非常有趣的是，反義抑制OsHI-LOX 突變體削弱了機械損傷和昆蟲取食誘導的JA 合成，降低對咀嚼式口器昆蟲二化螟Chilo suppressalia Walker 和稻縱葉螟Cnaphalocrosis medinalis Guenee 的抗性，但是卻增加了對刺吸式口器昆蟲褐飛虱(Nilaparvata lugens St?l)的抗性(Zhou et al.，2009)。我們最近的研究表明Osr9-LOX1 是一個僅有C9 催化活性的脂氧合酶，反義抑制Osr9-LOX1 基因突變體植株as-r9lox1 表現(xiàn)為更加抗二化螟，Osr9-LOX1 可以通過調(diào)控13-LOX 途徑影響水稻對昆蟲的誘導抗性(Zhou et al.，2014)。研究表明，水稻LOX 基因家族中有8 個成員被二化螟取食脅迫調(diào)控(Zhou et al.，2011)，其中OsHI-LOX、OsLOX1 和Osr9-LOX1 的抗蟲功能已被較好的研究(Wang et al.，2008;Zhou et al.，2009;Zhou et al.，2014)?？梢?，水稻脂氧合酶家族基因生物功能存在差異，在蟲害誘導的水稻防御反應中扮演不同的角色。

水稻是重要的糧食作物，世界上一半以上的人口以水稻為主糧(Cheng et al.，2013)。在我國，水稻是最主要的糧食作物，水稻生產(chǎn)直接關系到我國的糧食安全。二化螟 (Striped stem borer，SSB)是水稻的主要害蟲之一。本文克隆了一個蟲害脅迫誘導水稻LOX 基因OsRCI-1，研究了其在二化螟取食為害后的時序表達譜;并通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術獲得了OsRCI-1 基因沉默水稻突變體ir-rci;利用獲得的突變體，檢測了水稻OsRCI-1 基因?qū)ΧL發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 水稻品種和實驗昆蟲

供試水稻品種為秀水11 (XS11)及OsRCI-1的RNA 干擾基因沉默株系ir-rci。水稻種子于光照培養(yǎng)箱催芽后，移入組培瓶(直徑6.5 cm，高9.0 cm)，置于溫室(溫度28±2℃，濕度60%±10%，光照L∶D=16∶8)培養(yǎng)10 d，后移栽到盛土的塑料杯中，每杯移栽1 株。移栽的水稻苗在溫室(溫度28±2℃、濕度60%±10%、光照L∶D=16∶8)中生長，每天澆水，每周施濃度1 g/L的尿素水溶液10 mL，35-40 d 后用于各種實驗。

二化螟幼蟲采自中國水稻研究所農(nóng)場(浙江富陽)，在室內(nèi) (溫度26± 2℃、濕度70%±10%、光照L∶D=18∶6)，以Taichung Native 1(TN1)水稻幼苗飼養(yǎng)和繁殖至少1 代后用于各種實驗。

1.2 二化螟取食為害后的水稻脂氧合酶基因表達分析

移栽后35-40 d 水稻XS11 用自來水沖洗干凈，每株水稻莖桿接饑餓2 h 的二化螟3 齡幼蟲1頭，待二化螟鉆入水稻莖桿1/2 體長開始計時，在二化螟為害后0、0.5、1、2、4、8、12、24 和48 h 剪下二化螟為害處2-3 cm 長水稻莖桿，迅速除去二化螟幼蟲，立即放液氮冷凍，后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA 用SV Total RNA Isolation System(Promega)試劑盒提取，具體方法參照試劑盒說明書。100 ng 總RNA 以ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)試劑盒合成cDNA，具體方法參照試劑盒說明書。蟲害誘導水稻脂氧合酶基因OsHI-LOX 2(LOC _ Os03g52860)、OsHI-LOX 3 (LOC _Os08g39850)和OsRCI-1 (LOC_ Os12g37260)表達豐度檢測以TaqMAN 定量PCR 法進行，以OsACT 基因(LOC_ Os03g50885)作為內(nèi)參基因，定量PCR 所用試劑盒為Premix Ex TaqTM Kit(TaKaRa)，所用引物及探針序列見表1。

表1 QRT-PCR 引物及探針Table 1 Primers and probes used for QRT-PCR of target genes

1.3 水稻OsRCI-1 基因的克隆和序列分析

根據(jù) TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫中LOC_ Os12g37260 的序列設計特異性引物RCI-F:5'-ATGCTCACGGCCACGCACGCA GACTC-3'和RCI-R:5'-TCAAATTGAGATG CTGTTGGGGA-3'。PCR 反應總 積20 μL:cDNA 1 μL，特異性引物各1 μL，dNTP 2 μL，2×buffer 10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TakaRa)0.2 μL，ddH2O 4.8 μL。反應程序為:98℃10 s，50℃1 min，68℃3 min，5 次循環(huán);98℃10 s，72℃3 min，35 次循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴增出目的片段，用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen)割膠試劑盒回收，后經(jīng)加A 后連接入pGEM-T Easy (Promega)載體，挑選4 個陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。序列用Prosite 軟件(http://www.expasy.org/)和NetPhosK 1.0 軟件 (http://www.cbs.dtu.dk)進行蛋白基序(Motif)、功能結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點分析。

1.4 RNAi 載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

OsRCI-1 基因的特異性片段分別正向和反向連接入植物表達載體內(nèi)含子(intron)的兩端，組合的編碼序列置于CaMV 35S 啟動子和NOS 終止子之間以獲得一個完整的RNAi 表達框。正向序列插入，根據(jù)測序結(jié)果設計特異性引物iRC +F:5'-ATGGTCGACCGCCCCTTCTTCCTTCTCCA-3'，iRC +R:5'-CTTGGTACCGTCCTGCTTCAAGCTCA CCGT-3' (下劃線分別是SalI 和KpnI 的酶切位點);以獲得的OsRCI 質(zhì)粒為模板，反應為體系20 μL (特異性引物各1 μL，dNTP 2 μL，2×buffer 10 μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0.2 μL，ddH2O 補足)，反應程序 (98℃ 10 s，66℃ 20 s，反應循環(huán)35 次，最后72℃延伸5 min)，擴增出的217 bp 目的片段，電泳割膠回收后經(jīng)SalI 和KpnI 雙酶切后與經(jīng)同樣內(nèi)切酶消化的載體連接，構(gòu)建的載體經(jīng)酶切及測序驗證。在此基礎上，以特異性引物 iRC-F:5'-CTAGGATCCCGCCCCTTCTTCCTTCTCCA-3'，iRC-R:5'-GACTCTAGAGTCCTGCTTCAAGC TCACCGT-3' (下劃線分別是BamHI 和XbaI 的酶切位點)，擴增出目的片段，電泳割膠回收經(jīng)BamHI 和XbaI 雙酶切后克隆進載體的XbaI 和BamHI 的位點，篩選陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序確定。

構(gòu)建的OsRCI-1 基因的RNAi 植物表達載體pRNAi-RCI 質(zhì)粒1 μg 采用電擊法導入農(nóng)桿菌工程菌株EHA105，陽性克隆經(jīng)PCR 及測序鑒定，獲得含質(zhì)粒pRNAi-RCI 的工程農(nóng)桿菌用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化參考Hier 等的方法進行(Hiei et al.，1994)。含pRNAi-RCI 質(zhì)粒的工程農(nóng)桿菌單克隆接種于YEP 液體培養(yǎng)基，于28℃，250 rpm 條件下在溫控搖床培養(yǎng)至OD=0.5，菌液離心后以侵染培養(yǎng)基重懸獲得侵染用菌液，將水稻XS11 成熟胚誘導的愈傷組織置于侵染菌液30 min 后，取出愈傷組織在濾紙上晾干后放置共培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2 d;之后，將愈傷組織置含潮霉素的抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得的抗性愈傷經(jīng)預分化、分化、生根后獲得OsRCI-1 的RNAi突變體水稻。

1.5 OsRCI-1 的RNAi 突變體目的基因OsRCI-1沉默效果監(jiān)測

因為茉莉酸能誘導 OsRCI-1 的表達(Schaffrath et al.，2000)。對野生型XS11 和突變體植株ir-rci 水稻均勻噴灑2 mL 茉莉酸溶液(100 μg/mL)，處理6 h 后，剪取倒數(shù)第2 完全伸展葉，立即浸入液氮冷凍后置-80℃冰箱保存。植物總RNA 提取、cDNA 合成以及定量PCR 見方法材料與方法1.2。

1.6 二化螟的生物測定

野生型XS11 和突變體植株ir-rci，每株接入二化螟2 頭初孵幼蟲，將接蟲后的水稻放入人工氣候室內(nèi)(溫度28±2℃、濕度60%±10%、光照L∶D=16∶8)繼續(xù)培養(yǎng)，13 d 后從各株水稻中剝出二化螟并稱重，各處理至少30 個重復。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實驗設計和統(tǒng)計分析原理，對所得的實驗數(shù)據(jù)用Statistica 6.0 (StatSoft)軟件進行t-test檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲害誘導水稻LOX 基因在二化螟取食后的時序表達特征

圖1 二化螟處理水稻莖桿水稻LOX 基因的表達特征Fig.1 Relative expression levels of three herbivore-induced riceLOX in SSB-infested rice plants

本研究選擇3 個受蟲害誘導LOX 基因(Zhou et al.，2011)，并對其mRNA 表達特征進行了分析(如圖1)。結(jié)果表明，3 個受蟲害誘導的水稻脂氧合酶中，OsHI-LOX 2 (LOC_ Os03g52860) (圖1A)在水稻莖桿中的相對表達量較高，而OsHI-LOX 3 (LOC_ Os08g39850) (圖1B)相對表達量最低。二化螟取食處理都能顯著地誘導這3 個LOX基因的表達，其中OsHI-LOX 2 (圖1A)和OsHI-LOX 3 (圖1B)分別在二化螟取食8 h 和4 h 后mRNA 水平開始顯著積累，并且之后一直持續(xù)不斷增加。而OsRCI-1 (LOC_ Os12g37260)表達水平與0h 對照相比，二化螟處理后0.5 h 即顯著地增加，隨著二化螟取食時間推移其表達量不斷的積累(圖1C)，說明該基因在二化螟取食初期即對防御信號作出了應答，并一直保持較高的表達水平，因此我們選擇該基因作進一步研究。

2.2 水稻OsRCI-1 基因的克隆和序列分析

圖2 OsRCI-1 基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 Electrophoresis analysis ofOsRCI-1 PCR product

以RCI-F 和RCI-R 為引物，用高保真DNA Taq 酶擴增出一條約2800 bp 的特異性條帶(如圖2)。割膠回收該條帶，連接入pGEM-T easy 克隆載體，挑選4 個陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結(jié)果進行拼接獲得2769 bp 序列(圖3)，推測編碼922 個氨基酸，預測編碼蛋白分子量為105 kDa。序列在NCBI 網(wǎng)站進行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)其基因序列與日本栽培稻(Kusabue)的OsRCI-1 基因(AJ270938)序列完全一致。ExPASy 網(wǎng)站Prosite 軟件進行蛋白功能域掃描，發(fā)現(xiàn)了編碼的蛋白只有LIPOXYGENASE 一個Motif (如圖3A)，表明克隆的OsRCI-1 具有脂氧合酶(lipoxygenase)的功能。蛋白磷酸化在水稻抗蟲防御信號傳導中起非常重要的作用，因此用NetPhosK 1.0 軟件對OsRCI-1 蛋白磷酸化位點進行了分析，發(fā)現(xiàn)有13 個位點可被蛋白激酶PKC所磷酸化(表2)。

表2 OsRCI-1 蛋白可被PKC 蛋白激酶磷酸化的位點Table 2 The putative phosphorylation site of OsRCI-1 by protein kinase PKC

2.3 載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

為了進一步明確OsRCI-1 的抗蟲功能，我們設計了引物擴增出一段217 bp 的OsRCI-1 特異性片段(圖3 下劃線序列)，分別正向和反向插在內(nèi)含子(intron)的兩端，構(gòu)成目的基因片段互補發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖4)，將該發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)置于CaMV35 啟動子和NOS 終止子之間，構(gòu)建沉默OsRCI-1 的RNAi 植物表達載體pRNAi-RCI。RNAi 載體pRNAi-RCI 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，陽性克隆經(jīng)菌落PCR 驗證后，用于水稻胚性愈傷侵染。獲得的抗性愈傷經(jīng)潮霉素抗性篩選、分化和生根，獲得RNAi 的水稻株系用于后續(xù)研究(圖5)。

圖3 克隆的OsRCI-1 基因序列和推導的氨基酸序列及其結(jié)構(gòu)域Fig 3 Sequence ofOsRCI-1 and its deduced amino acid sequence and it’s motif

圖4 水稻基因RCI-1 沉默原理Fig.4 The rice geneRCI-1 silencing principle

圖5 轉(zhuǎn)基因突變體的獲得Fig.5 Construction of transgenic plants

2.4 突變體株系中目的基因表達被顯著抑制

為了明確RNAi 突變體株系中目的基因OsRCI-1 的轉(zhuǎn)錄水平，我們利用QRT-PCR 對RNAi 突變體株系ir-rci-1 和ir-rci-2 進行了檢測。結(jié)果表明，這兩個株系中OsRCI-1 基因的表達量顯著降低，ir-rci-1 和ir-rci-2 中目的基因表達豐度分別只有野生型XS11 表達量的47.73% 和32.33% (如圖6)。

圖6 突變體ir-rci 和野生型中OsRCI-1 基因的相對表達量(n=5;*，P＜0.05，t-test)Fig.6 The relative expression level ofOsRCI-1 gene in ansgenic rice plants and WT line (n=5;*，P＜0.05，t-test)

2.5 抑制OsRCI-1 表達降低水稻對二化螟直接抗性

為了明確RNAi 的兩個株系ir-rci-1 和ir-rci-2 對二化螟生長發(fā)育的影響，測定了二化螟初孵幼蟲在野生型水稻和RNAi 突變體ir-rci 株系的生長情況。在接入二化螟初孵幼蟲13d 后，剝出二化螟稱重，結(jié)果表明取食ir-rci-1 和ir-rci-2株系的二化螟的體重分別為取食野生型XS11 的1.58 倍和2.15 倍(圖7 A)。野生型水稻對二化螟取食為害的耐害能力明顯比ir-rci 品系要強，二化螟為害13d 后兩個突變體品系ir-rci 生長被完全抑制，表現(xiàn)為枯心并且外側(cè)葉子枯黃，而野生型水稻僅外葉鞘發(fā)黃(如圖7B)。

3 結(jié)論與討論

圖7 突變體ir-rci 和野生型XS11 水稻對二化螟的抗性Fig.7 The resistance of ir-rci lines and WT plants to SSB infestation

本研究用QRT-PCR 檢測了水稻3 個脂氧合酶基因OsHI-LOX 2/LOC_ Os03g52860、OsHI-LOX 3/LOC_ Os08g39850 和 OsRCI-1/LOC _Os12g37260 在二化螟取食后的表達動態(tài)，結(jié)果表明3 個基因均被二化螟取食脅迫信號所誘導，該結(jié)果與Zhou 等2011年的結(jié)論一致(Zhou et al.，2011)。此外，這3 個水稻LOX 基因雖然都能被二化螟取食誘導，但是其誘導表達動態(tài)存在差異，表明這3 個LOX 基因可能在水稻誘導抗蟲防御反應中存在差異。其中，OsRCI-1 基因表現(xiàn)出對二化螟取食信號快速及持續(xù)應答反應，我們推測該基因可能在水稻對二化螟的防御反應中起重要的作用，并對該基因進行了詳細研究。從秀水11 水稻品種中克隆的OsRCI-1 經(jīng)測序與日本栽培稻(Kusabue)的OsRCI-1 基因序列完全一致。前人的研究表明，用植物獲得性抗性誘導化合物benzol(1，2，3)thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH)和2，6-dichloroisonicotinic acid (INA)處理均能誘導水稻體內(nèi)OsRCI-1 的積累(Schaffrath et al.，2000)。并且過量表達OsRCI-1 基因，會導致水稻葉片病程相關蛋白OsPR1 的積累(Zabbai et al.，2004)，說明OsRCI-1 基因可能與水稻抗病性密切相關。機械損傷處理不能誘導OsRCI-1 表達(Schaffrath et al.，2000)，但能被二化螟取食所誘導(圖1)，說明OsRCI-1 是二化螟取食脅迫信號調(diào)控的特異性基因，能特異識別二化螟取食所釋放的特異誘導信號。OsRCI-1 是定位于葉綠體13-LOX 催化活性脂氧合酶，用該信號途徑的產(chǎn)物茉莉酸處理能顯著增加水稻葉片OsRCI-1 表達 (Schaffrath et al.，2000;Zabbai et al.，2004)，水稻中OsRCI-1 介導的防御反應途徑可能存在一個正反饋調(diào)控的機制。

RNAi 抑制OsRCI-1 基因表達，導致水稻對二化螟的抗性減弱，植物的耐害性降低，OsRCI-1 沉默的兩個株系ir-rci-1 和ir-rci-2 明顯的對二化螟取食更加敏感(圖7)。這一結(jié)果與我們先前研究水稻13-LOX 基因OsHI-LOX 正調(diào)控對二化螟抗性的功能相類似(Zhou et al.，2009)，但是OsRCI-1 催化產(chǎn)物是否供給水稻體內(nèi)茉莉酸(JA)或綠葉性氣味(GLVs)合成還需要進一步的實驗證實。與水稻OsHI-LOX 和OsRCI-1 相反，水稻Osr9-LOX1 基因負調(diào)控水稻對二化螟的抗性，并且Osr9-LOX1 是通過調(diào)控13-LOX 途徑影響水稻對昆蟲的誘導抗性 (Zhou et al.，2014)。反義抑制OsHI-LOX 基因突變體植株aslox 表現(xiàn)為對二化螟更加敏感是由于as-lox 中蟲害誘導茉莉酸合成受到抑制，導致抗蟲物質(zhì)蛋白酶抑制劑(TrypPIs)合成減少(Zhou et al.，2009)。OsRCI-1 的RNAi 水稻突變體ir-rci 對二化螟取食表現(xiàn)為更加敏感，是否也是由于蟲害誘導茉莉酸合成減少導致抗蟲防御物質(zhì)TrypPI 含量降低，即OsRCI-1 基因介導的水稻誘導抗性產(chǎn)生機制還有待進一步研究。

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