豬圓環(huán)病毒病原學(xué)研究進(jìn)展

王志軍等

摘 要：豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）有2種不同的血清型，即豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）。目前研究表明PCV1暫無致病性，但PCV2則被認(rèn)為是引起豬圓環(huán)疾?。≒CVDs）的主要病原。很多地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益因此而遭受了重大的影響。PCV現(xiàn)已受到全球的關(guān)注，引起了許多專家學(xué)者的高度重視。本文對(duì)PCV的病原學(xué)最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒；PCV2；病原特性；基因結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S852.65+9.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.017

Abstract： Porcine circovirus virus （PCV） has 2 serotype， named porcine circovirus virus type 1 （PCV1） and porcine circovirus type 2 （PCV2）. PCV1， the first discovered one， has no pathogenity to pigs， while PCV2， the newly defined virus，is recognized as one of the main pathogens for PCVDs. The disease has prevalented in many countries and cause huge economic loss and also pose great challenges to the pig production industry. It is highly valued by scholars in Home and Abroad. This paper reviewed the development of the pathogeny of PCV2.

Key words： porcine circovirus； PCV2； pathogen characteristics； genetic structure

1 發(fā)現(xiàn)及分類地位

迄今，人們對(duì)豬圓環(huán)病毒的起源和進(jìn)化過程了解得并不多?？勺匪莸淖钤绲挠嘘P(guān)于PCV感染豬群的資料是在1962年的德國(guó)[1]。Hans Nauwynck 博士通過血清學(xué)方法研究證實(shí)，豬圓環(huán)病毒于20世紀(jì)70年代以前就已出現(xiàn)。1974年，Tischer I 等首次報(bào)道在PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（PCV1），由于該病毒不引起細(xì)胞發(fā)生病變，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為僅僅是一種細(xì)胞污染物。通過深入研究，Tischer I 等[2]進(jìn)一步證實(shí)這種細(xì)胞污染物實(shí)際上是一種單鏈的環(huán)狀DNA病毒， 并將其命名為豬圓環(huán)病毒。加拿大在1991年報(bào)道了一種新豬病——斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning pigs multi-systemic wasting syndrome， PMWS）。該國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)由于PMWS在豬群中的廣泛流行而遭受了很大的損失。Harding 和Clark 等從PMWS 的病料中分離鑒定出的病毒與已發(fā)現(xiàn)的PCV有70%的同源性，從而認(rèn)識(shí)到該病毒有不同的致病特性，故將無致病性的PCV命名為PCV1，有致病性的命名為PCV2。隨后，PCV2由地方性流行性疾病發(fā)展為動(dòng)物流行性疾病，并在全球的豬群中不斷感染擴(kuò)散，引發(fā)了一系列豬圓環(huán)病毒疾?。≒orcine circovirus diseases，PCVDs）[3]，該病毒不僅可感染家豬群，也在野豬群中廣泛傳播。雖然很少出現(xiàn)臨床癥狀，但其仍被認(rèn)為是全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的病原之一。在PCV2疫苗問世前，亦有諸多專家學(xué)者認(rèn)為與豬圓環(huán)相關(guān)的疾?。≒CV2-systemic disease ，PCV2-SD）的出現(xiàn)和傳播其實(shí)與PCV2并無太多關(guān)聯(lián)，而是與其他某個(gè)尚不確定的因素[4] “agent X”[5]有關(guān)。然而，也有人認(rèn)為疾病爆發(fā)的主要原因并不是外來的傳染源。隨著PCV2疫苗的問世，PCV2被證明是引發(fā)PCV2-SD的主要原因，關(guān)于PCV2疾病爆發(fā)的“因果論”的爭(zhēng)辯也因此結(jié)束，但對(duì)于病毒由地方流行性發(fā)展為動(dòng)物流行性的原因還有待進(jìn)一步的研究。

在第八次國(guó)際病毒學(xué)會(huì)議上，將脊椎動(dòng)物的圓環(huán)病毒分為圓環(huán)病毒（Cir-covirus）和環(huán)病毒（Gyrovirus）兩個(gè)屬。

2 形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化特性

PCV是已知最小的感染哺乳動(dòng)物的病毒[6]，其直徑約12～23 nm[7]，呈二十面體對(duì)稱，無囊膜，病毒的基因組是一條共價(jià)結(jié)合的閉環(huán)單鏈DNA，衣殼蛋白由單肽鏈組成，分子量為36 kDa。根據(jù)其基因序列、致病性和抗原性的差異，將PCV劃分成PCV1和PCV2兩個(gè)型。PCV對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力較強(qiáng)，在72 ℃高溫條件下能存活15 min，在酸性環(huán)境（如pH3）和氯仿中也能存活很長(zhǎng)的時(shí)間。該病毒對(duì)苯酚、氧化劑、氫氧化鈉和季胺類化合物等比較敏感，以上消毒劑可用于PCV的消毒[8]。PCV沒有血凝活性，不能凝集豬、牛、羊、雞等動(dòng)物和人的紅細(xì)胞[9]。PCV1和PCV2在理化特性方面的差異不是很明顯。

3 組織培養(yǎng)特性

PCV能夠在增殖能力旺盛、正在進(jìn)行有絲分裂的PK-15細(xì)胞上復(fù)制，該病毒的復(fù)制主要依賴于處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞蛋白及酶[10]。Tischer等[11]將PCV2接種到?jīng)]有污染PCV的PK-15單層細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)PCV2能夠增殖并形成漿內(nèi)包涵體或核內(nèi)包涵體；接種PCV的PK-15細(xì)胞用D-氨基葡萄糖處理，對(duì)病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核有著促進(jìn)作用，增加30%的細(xì)胞感染量。Stevenson等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)PCV2在PK-15細(xì)胞上的培養(yǎng)時(shí)間（24 h），也可以獲得良好的病毒增殖效果。除PK-15細(xì)胞外，PCV還可以在其他細(xì)胞中復(fù)制，如牛外周血單核細(xì)胞、外周血液細(xì)胞、豬骨髓細(xì)胞等。但PCV2對(duì)RK和Vero細(xì)胞的適應(yīng)性比較差，且在PT、ST、PET等傳代細(xì)胞系和BHK-21細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞、原代胎豬腎細(xì)胞等細(xì)胞上不能增殖。Taís F.等[13]發(fā)現(xiàn)，如果用收毒技術(shù)（Shell vial technique）培養(yǎng)接種于ST細(xì)胞的PCV2，可以收到比傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)更好的效果。

4 基因組特征及分型

PCV的基因組非常小而且核苷酸序列非常保守，PCV1的基因組只含有1 759 nt，PCV2基因組則分為3種：1 766 nt、1 767 nt和1 768 nt。研究表明，PCV1和PCV2可能有相同的進(jìn)化起源，其中PCV1突變率是每年1.15×10-5個(gè)變異位點(diǎn)[14]，PCV2則是每年1.2×10-3個(gè)變異位點(diǎn)[15]。不同PCV2毒株之間基因序列的同源性大于96%，而PCV1相對(duì)保守，不同毒株之間核苷酸序列的同源性大于99%[16]。PCV1和PCV2核苷酸的相似性是68%，基因序列推導(dǎo)出的aa同源性小于76%?，F(xiàn)預(yù)測(cè)PCV基因組含有11個(gè)潛在的開放閱讀框（Open reading frames， ORFs），大部分閱讀框大小相差很大，且存在部分重疊的現(xiàn)象。有一定同源性的開放閱讀框有ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF7和ORF8，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10的5-3方向均為順時(shí)針方向，其余的ORF則為逆時(shí)針方向。

迄今，已經(jīng)報(bào)道的PCV2包括4個(gè)基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。其中PCV2a和PCV2b 是主要的基因型，PCV2c亞型毒株目前只有丹麥分離并報(bào)道，而PCV2d不僅發(fā)現(xiàn)于中國(guó)，可能還出現(xiàn)在歐洲野豬群和南美洲。我國(guó)報(bào)道的PCV2分離毒株的基因型主要是PCV2a和PCV2b，其中PCV2b已成為近年來國(guó)內(nèi)流行范圍最廣的基因型[17]。雖然PCV2b的流行與各國(guó)近年P(guān)CVDS的頻繁爆發(fā)在時(shí)間和空間上可能相符，但PCV2基因型的轉(zhuǎn)變?nèi)詫儆赑CVDS進(jìn)化的未解之謎。

5 復(fù) 制

PCV依賴雙鏈DNA （dsDNA）中間體從而完成自身復(fù)制，dsDNA 也就是人們說的復(fù)制型（Replicative form，RF）。RF是雙義的，其負(fù)鏈主要編碼ORF2和ORF3，正鏈主要編碼ORF1。PCV的主要開放閱讀框是ORF1和ORF2，其5'端和3'端分別由基因間區(qū)（Intergenic region， IR） Ori和編碼終止處IR隔開。 ORF1非常保守，有研究表明，PCV1和PCV2的rep和Ori可以完全替換；比較而言，ORF2變異程度相對(duì)較大[18]。PCV主要在單核巨噬細(xì)胞中復(fù)制，是能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制的最小病毒，其復(fù)制主要是滾環(huán)模式。Mankertz等發(fā)現(xiàn)，該病毒滾環(huán)復(fù)制時(shí)正鏈合成的起點(diǎn)位于PCV1基因組ORF1與ORF2的中間區(qū)域的728～838 nt處，長(zhǎng)111 bp。這段片段包括圓環(huán)病毒屬特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu) TAGTATTACC 或AAGTATTACC （stem-loopstructure），其頂端的保守九核苷酸基序（nonanucleotide motiof）是滾環(huán)復(fù)制的剪切位點(diǎn)。位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游還有該區(qū)域的特異性結(jié)構(gòu)，即4個(gè)六聚體重復(fù)（5'-CGGCAG-3'） （ H1， H2， H3， H4 ），是病毒復(fù)制酶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)椴《菊湹钠鹗键c(diǎn)和終止點(diǎn)都在這個(gè)保守基元中定位，所以病毒復(fù)制的關(guān)鍵是九核苷酸序列，該保守序列的第7和8個(gè)堿基之間被核酸酶切開，進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。

6 編碼蛋白

6.1 ORF1編碼的蛋白

ORF1全長(zhǎng)945 nt，由312 aa（PCV1）或314 aa（PCV2）組成，分子量大小為35.8 kDa，編碼后可形成分子量約為36 kDa的Rep蛋白，Rep基因轉(zhuǎn)錄后剪輯的產(chǎn)物為分子量為19.2kDa的Rep'蛋白。Rep必須和Rep'相互作用才可以促進(jìn)PCV的復(fù)制過程，單獨(dú)啟動(dòng)病毒的復(fù)制是不可能的。Rep蛋白含有結(jié)合dNTPs的P環(huán)（P-loop ）結(jié)構(gòu)（序列為G—GKS ）、3個(gè)糖基化位點(diǎn)以及與典型滾環(huán)復(fù)制（RCR）相關(guān)的3個(gè)保守基序，這些結(jié)構(gòu)對(duì)維持Rep蛋白的功能非常重要，發(fā)生突變或缺失，均會(huì)影響病毒的復(fù)制。在PCV2體外感染PK-15細(xì)胞的試驗(yàn)中，該病毒感染后可產(chǎn)生10種RNA[19]，其中5種與Rep蛋白相關(guān)，分別為Rep（1 000 nt）， Rep' （750 nt）， Rep3a（280 nt）， Rep3b（280 nt）和Rep3c（470 nt），這些RNA具有相同的5'和3'端核苷酸序列。研究表明，Rep mRNA可能是病毒基因組的初始轉(zhuǎn)錄物，其余mRNA的功能目前尚不明了。

6.2 ORF2編碼的蛋白

ORF2主要編碼構(gòu)成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白（Capsid protein， Cap），該蛋白是由60個(gè)Cap亞單位組成的二十面體[20]，包括702個(gè)核苷酸，含有233或234個(gè)aa，分子量大小約為27.8 kDa。Cap蛋白與病毒和宿主細(xì)胞結(jié)合有關(guān)，且對(duì)Rep和Rep'蛋白的復(fù)制轉(zhuǎn)運(yùn)起一定作用[21]。ORF2基因的啟動(dòng)子位于Rep基因內(nèi)部的1 428～1 168 nt處，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在1 238 nt，轉(zhuǎn)錄子是一個(gè)119 nt的非翻譯引導(dǎo)序列。通過多肽掃描分析，發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白上存在一個(gè)PCV共同的抗原決定簇及3個(gè)特有的抗原位點(diǎn)，即65-87aa， 113-139aa和193-20aa，這一特點(diǎn)為建立區(qū)分其它圓環(huán)病毒的PCV2的特異性血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)。Fenaux等研究發(fā)現(xiàn)，CP110位（P-A）和191位（R-S）氨基酸發(fā)生改變可以增強(qiáng)病毒的體外復(fù)制，但會(huì)減弱病毒在體內(nèi)的毒力。2003年他們發(fā)現(xiàn)用感染性克隆構(gòu)建的來自PCV1 ORF1及PCV2 ORF2重組病毒在豬體內(nèi)無致病性。

7 結(jié) 語

PCV2所引發(fā)的一系列PCVDs給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害。對(duì)于該病及其病原，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，對(duì)其相關(guān)疫苗的研制也取得了突破性進(jìn)展[22]，接種疫苗是目前國(guó)內(nèi)外防治該病最有效也是最有收益和回報(bào)的方法。但現(xiàn)今仍有許多問題亟待解決：如最近一種發(fā)生于接種豬群的新的疾病——急性肺水腫（Acute pulmonary edema ，APE），似乎與PCV2疫苗的接種有關(guān)[23]；國(guó)外有報(bào)道仔豬在接種55 d后分離出了PCV1，且在接種的21 d后出現(xiàn)肺部損傷，似乎證明PCV1也是具有致病性的[24]。因此，我們應(yīng)該對(duì)PCV2的致病機(jī)理等問題進(jìn)行更深入的研究，以期為推進(jìn)此項(xiàng)研究的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

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