醋制降低京大戟細(xì)胞毒性部位對(duì)小鼠肝臟氧化損傷機(jī)制研究

曹雨誕，陳海鷹，張 麗，丁安偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046)

京大戟為大戟科植物大戟(Euphorbia pekinensisRupr.)的干燥根［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，為中醫(yī)臨床常用的峻下逐水藥。其性寒，味苦，有毒。由于其生品毒性較大，故采用醋制法降低京大戟的毒性，緩和其瀉下作用［2］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)京大戟的細(xì)胞毒性部位為石油醚、乙酸乙酯部位［3］，但有關(guān)醋制降低京大戟毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚缺乏明確的揭示。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用整體動(dòng)物模型，通過(guò)多次給予小鼠京大戟生品和醋品細(xì)胞毒性部位提取物，比較醋制前后對(duì)小鼠的肝組織形態(tài)和氧化損傷的影響，初步探討醋制降低京大戟對(duì)小鼠肝毒性的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究京大戟醋制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠70只，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(浙)2008－0033。

1.2 藥物 京大戟飲片購(gòu)于安徽省亳州市藥材總公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)樂(lè)巍副教授鑒定為大戟科植物大戟Euphor-bia pekinensisRupr.的塊根。京大戟生品:取凈京大戟飲片2 kg，打粉;京大戟醋品:取凈京大戟飲片2 kg，用米醋600 g悶潤(rùn)，加水稀釋至3 000 ml，繼續(xù)悶潤(rùn)，文火煮沸至醋吸凈，取出，室溫晾干，40℃減壓干燥，打粉。

將京大戟生品和醋品粗粉(過(guò)2號(hào)篩)以6倍量乙醇回流提取3次，回收乙醇提取液，得到京大戟生、醋品醇提浸膏(得率分別為13.65%和15.64%)，醇提浸膏用水懸浮，懸浮物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到京大戟生、醋品石油醚部位和乙酸乙酯部位混合浸膏(得率分別為10.12%和9.01%)。臨用前，用0.5%的CMC-Na溶液和食用油(9∶1)分別配成所需濃度的藥液。

1.3 試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、RM2135型石蠟切片機(jī)、DM1000光學(xué)顯微鏡(均為德國(guó)LEICA公司)，CS-VI型攤片烤片機(jī)(湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，Tissue-Tek TEL組織包埋機(jī)(日本SAKURA公司)，powerwave X340全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，AY220電子分析天平(日本島津)，TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 小鼠按體重隨機(jī)分為7組，即空白對(duì)照組，京大戟生品細(xì)胞毒性部位高、中、低劑量組，京大戟醋品細(xì)胞毒性部位高、中、低劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫、通風(fēng)的清潔級(jí)動(dòng)物室中，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。2.2 劑量設(shè)計(jì) 按照人臨床用量的6、4、2倍，并結(jié)合本課題組前期預(yù)試結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)京大戟生品和醋品高、中、低劑量組分別灌胃給予60、40、20 mg·g－1，空白對(duì)照組灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液和食用油(9∶1)，每日兩次，連續(xù)灌胃6 d。

2.3 肝功能指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后，禁食16 h，不禁水，小鼠稱重，摘眼球取血，待血清析出后，3 500 r·min－1，10 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行ALT、AST、LDH活性的測(cè)定。

2.4 肝臟氧化損傷指標(biāo)測(cè)定 稱取0.5 g肝組織，加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水，冰浴勻漿，制成10%肝組織勻漿，3 500 r·min－1，10 min，吸取上清，用 BCA 法測(cè)定蛋白含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD活性、MDA含量、GSH含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組定量檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。

Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT，AST，LDH on liver function and the levels of SOD，GSH and MDA in liver tissue(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT，AST，LDH on liver function and the levels of SOD，GSH and MDA in liver tissue(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Crude

Group ALT/U·Pro Control 8.182 ±0.377 8.910 ±2.404 11860 ±599 0 L－1 AST/U·L－1 LDH/U·L－1 MDA/μmol·g－1Pro GSH/mg·g－1Pro SOD/U·mg－1.220 ±0.137 0.828 ±0.072 15.25 ±0.245 Crude 20 mg·g－116.16 ±1.267＊＊ 22.24 ±3.036＊＊ 15509 ±1126* 1.284 ±0.351＊＊ 0.326 ±0.064＊＊ 8.371 ±0.919＊＊40 mg·g－120.63 ±0.743＊＊ 31.66 ±2.229＊＊ 18667 ±978＊＊ 1.612 ±0.349＊＊ 0.238 ±0.023＊＊ 4.221 ±0.858＊＊60 mg·g－127.61 ±1.139＊＊ 45.69 ±2.438＊＊ 22456 ±851＊＊ 1.955 ±0.326＊＊ 0.194 ±0.016＊＊ 2.073 ±0.933＊＊Vinegar 20 mg·g－111.97 ±0.911# 12.42 ±1.374# 12982 ±677# 0.635 ±0.145# 0.561 ±0.093# 11.21 ±0.608##40 mg·g－115.70 ±0.569## 20.00 ±2.489## 15053 ±1671# 0.969 ±0.305# 0.408 ±0.040## 8.037 ±1.078##60 mg·g－119.57 ±1.900## 34.44 ±1.124## 19123 ±790## 1.193 ±0.334# 0.322 ±0.014## 3.862 ±0.588##

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 空白對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯異常，京大戟生品和醋品給藥組小鼠均表現(xiàn)出少食、少動(dòng)、精神不佳、毛發(fā)無(wú)光澤、下腹腫脹、體重降低等癥狀，并隨給藥劑量增加而癥狀加重。

3.2 京大戟醋制前后對(duì)小鼠肝功能的影響 與空白對(duì)照組比較，60、40、20 mg·g－1京大戟生品均明顯升高小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關(guān)性;與生品各劑量組比較，醋品各濃度組可明顯降低小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P＜0.05)，呈一定的劑量相關(guān)性，見(jiàn)Tab 1。

3.3 京大戟醋制前后對(duì)小鼠肝臟氧化損傷指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組比較，60、40、20 mg·g－1京大戟生品可明顯降低小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P＜0.01)，增加小鼠肝臟中MDA含量(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關(guān)性;與生品各濃度組比較，醋品各劑量組可明顯提高小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P＜0.01)，降低小鼠肝臟中MDA含量(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關(guān)性，見(jiàn)Tab 1。

4 討論

中藥致肝毒性損傷時(shí)，可使血中ALT、AST活性升高［4］;LDH是一種糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織器官中，LDH的釋放是細(xì)胞膜受損的敏感指標(biāo)之一［5］，因此ALT、AST和LDH可作為評(píng)價(jià)肝損傷程度的指標(biāo)［6］。氧化損傷機(jī)制是引起肝損傷的主要機(jī)制［7］，主要變化為丙二醛(MDA)含量升高，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量下降［8］，因此MDA、SOD和GSH可作為肝毒性氧化損傷程度的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，連續(xù)6 d給予小鼠不同劑量的京大戟細(xì)胞毒性部位后，小鼠血清中ALT、AST和LDH活性明顯增高，且隨給藥劑量增加而增高，呈現(xiàn)一定的“量－毒”關(guān)系。小鼠肝臟中SOD活性明顯下降，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加。該結(jié)果提示京大戟細(xì)胞毒性部位致小鼠肝損傷途徑可能與氧化損傷有關(guān)。

與京大戟生品組相比，連續(xù)6 d給予小鼠不同劑量的京大戟醋品細(xì)胞毒性部位后，肝功能損傷指標(biāo)明顯降低，氧化損傷指標(biāo)減輕，這個(gè)結(jié)果與前期的京大戟細(xì)胞毒性部位對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2毒性研究的結(jié)果相符［3］。上述結(jié)果提示醋制可明顯降低京大戟肝毒性，其可能機(jī)制為通過(guò)降低京大戟對(duì)肝細(xì)胞膜通透性的影響及減輕氧化損傷而實(shí)現(xiàn)，這為進(jìn)一步闡明京大戟醋制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供了的一定依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010版，一部:208.

［1］Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People＇s Republic of China［S］.Beijing:China Medical Science Press，2010，VolumeⅠ:208.

［2］邱韻縈，郁紅禮，吳 皓，等.大戟科大戟屬根類(lèi)中藥的毒性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2011，17(23):259－64.

［2］Qiu Y Y，Yu H L，Wu H.Research progress on toxicity of medicinal plants of Euphorbia［J］.Chin J Exp Tradit Med Formul，2011，17(23):259－64.

［3］陳海鷹，曹雨誕，顏曉靜，等.醋制降低京大戟對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2的毒性及機(jī)制研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38(6):866－70.

［3］Chen H Y，Cao Y D，Yan X J，et al.Study on detoxication and mechanism of vinegar-processed Euphorbia pekinensis on normal liver cells LO2［J］.Chin J Chin Mat Med，2013，38(6):866 －70.

［4］孫 蓉，楊 倩，黃 偉，等.肝功能相關(guān)指標(biāo)在中藥肝毒性損傷中作用與毒性相關(guān)程度分析［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(6):82.

［4］Sun R，Yang Q，Huang W，et al.Analysis of the related indexes of liver function in liver toxicity of traditional Chinese medicine in effect and toxicity of correlation degree［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2008，24(6):82.

［5］金惠銘.病理生理學(xué)［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2005:173.

［5］Jin H M.Pathophysiology［M］.Shanghai:Fudan University Press，2005:173.

［6］俸家富，涂植光.肝功能相關(guān)的血清酶學(xué)研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(3):225－30.

［6］Feng J F，Tu Z G.Progress of serum enzymology related to liver function［J］.Med Recap，2007，13(3):225 －30.

［7］楊惠玲.高級(jí)病理生理學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:24－30.

［7］Yang H L.Advanced pathophysiology［M］.Beijing:Science Press，1998:24－30.

［8］謝京兒，廖錫麟.藥物性肝損傷機(jī)制與脂質(zhì)過(guò)氧化［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1990，6(1):7.

［8］Xie J E，Liao X L.Drug induced liver injury and lipid peroxidation［J］.Chin Pharmacol Bull，1990，6(1):7.