田薊苷微乳在大鼠小腸吸收特性的研究

李 偉，袁 勇，邢建國(guó)，王立萍，陳衛(wèi)軍，王新春，

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832002;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子 832008;3.新疆自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

香青蘭(Dracocephalum moldevicaL.)為唇形科青蘭屬植物，具有治療高血壓、高血脂、心絞痛和冠心病作用，田薊苷(Tilianin)是其主要活性成分［1－2］。因其水溶性差，口服給藥吸收不理想［3］。為增加田薊苷溶解度，課題組前期進(jìn)行了微乳制備工藝的研究［4］。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)大鼠與人小腸生理狀況相似的特點(diǎn)［5］，采用大鼠在體單向灌流模型和外翻腸囊模型考察田薊苷腸灌流液、田薊苷微乳在大鼠各腸段吸收行為及其在小腸的吸收機(jī)制，探討微乳載體對(duì)田薊苷口服吸收的影響，為田薊苷新型給藥系統(tǒng)的口服制劑的設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜儀(安捷倫公司);T01-100蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器(保定蘭格恒流泵有限公司);TG16B型臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);AR-1140電子分析天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.2 試劑與試藥 田薊苷對(duì)照品、單體(純度＞98%、90%，自制);聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40，BASF公司);油酸(OA，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);無(wú)水乙醇(天津永晟精細(xì)化工有限公司);乙腈(色譜純，SK Chemicals公司);烏拉坦(上海行知化工廠);PBS(pH 6.8);其他試劑為分析純。1.3 動(dòng)物 SD大鼠(♀♂各半)，180～220 g，清潔 Ⅱ 級(jí)，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào):新醫(yī)動(dòng)字第2003－0001號(hào)。

2 方法

2.1 HPLC測(cè)定田薊苷含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水(35 ∶65)，流速:1.0 ml·min－1;柱溫:25℃;PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng):325 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

2.1.2 供試液配制 田薊苷儲(chǔ)備液:精密稱定田薊苷對(duì)照品，1∶1乙腈－水溶解。田薊苷腸灌流液:大鼠在體腸灌流液加田薊苷儲(chǔ)備液，超聲搖勻。田薊苷微乳:處方量 OA、RH 40、乙醇和水，攪勻;加入田薊苷單體，攪拌至溶散。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 制備 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸得方程=2.874X－1.338，r=0.9994，線性關(guān)系良好。

2.2 大鼠小腸對(duì)田薊苷微乳的吸收

2.2.1 大鼠在體單向灌流模型 參照文獻(xiàn)制備模型［6］，SD大鼠禁食12 h(自由飲水)，腹腔注射烏拉坦麻醉，開(kāi)腹結(jié)扎膽管，分離十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸。取10 cm結(jié)扎，沖洗內(nèi)容物，插管結(jié)扎，保濕。0.5 ml·min－1將 37℃ 田薊苷腸灌流液、微乳泵入腸段充滿藥液，30 min調(diào)至0.25 ml·min－1，記時(shí)。每15 min更換下一個(gè)供試液和收集液小瓶，于記時(shí)后 45、60、75、90、105 min取樣。剪下腸段測(cè)量長(zhǎng)度和內(nèi)徑。樣品加10倍乙腈，超聲10 min，10 000r·min－1離心10 min，按 HPLC 2.1.1取上清液測(cè)定，考察各腸段吸收，重量分析法校正，計(jì)算各腸段Ka和 Papp。

2.2.2 大鼠外翻腸囊模型 按照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行外翻腸囊實(shí)驗(yàn)［7］于15、45、75 min 量取腸外田薊苷腸灌流液、微乳。樣品處理同上。計(jì)算田薊苷吸收量、吸收百分率和Ke。

3 結(jié)果

3.1 大鼠小腸各腸吸收考察段 田薊苷、微乳在整個(gè)腸道均有吸收;微乳Ka、Papp:回腸 ＞十二指腸 ＞空腸 ＞結(jié)腸，與田薊苷實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)一致，且均高于田薊苷;經(jīng) SPSS統(tǒng)計(jì)分析:回腸與結(jié)腸存在顯著性差異(P＜0.05)，與田薊苷相比差異存在顯著性(P＜0.01)，見(jiàn) Tab 1。

3.2 不同濃度藥物吸收考察 7.0～28.0mg·L－1對(duì)Ka和Papp無(wú)明顯影響(P＞0.05)，不受質(zhì)量濃度影響，滿足 Fick's擴(kuò)散定律，均為被動(dòng)擴(kuò)散，Tab 2。

Tab 1 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME at various intestine segments in rats(±s，n=6)

Tab 1 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME at various intestine segments in rats(±s，n=6)

Intestine Tilianin Ka×10－2/min Papp×10－2/Papp×10－2/cm·min －1 Tilianin ME Ka×10－2/min cm·min －1 Duodenum 2.0948 ±0.12490.2333 ±0.0263 9.3003 ±0.5516 1.3590 ±0.1429 Jejunum 1.9061 ±0.1539 0.2111±0.0159 9.2928 ±0.5201 1.3651 ±0.0768 Ileum 2.1479 ±0.2197 0.2396±0.0398 11.4079 ±0.5425 1.6581 ±0.0750 Colon 1.8416 ±0.08410.2036±0.0114 5.7410 ±0.4520 1.1340 ±0.0485

Tab 2 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME with various consistence at ileum in rats(±s，n=6)

Tab 2 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME with various consistence at ileum in rats(±s，n=6)

Intestine Tilianin Ka×10－2/min Papp×10－2/Papp×10－2/cm·min －1 Tilianin ME Ka×10－2/min cm·min －1 7.0 2.0348 ±0.0578 0.2262±0.005810.5700 ±0.5262 1.5025 ±0.0634 14.0 2.0801 ±0.25390.2316±0.055412.0658 ±0.5157 1.7102 ±0.1384 28.0 2.1479 ±0.21970.2396±0.039811.4079 ±0.5425 1.6581 ±0.0750

3.3 大鼠外翻腸囊實(shí)驗(yàn) 以小腸內(nèi)剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)取樣時(shí)間做線性回歸，所得直線相關(guān)系數(shù)均大于0.99，初步確定田薊苷、微乳腸道吸收均屬一級(jí)動(dòng)力學(xué)。微乳吸收量和吸收率比田薊苷高出53.20%和170.35%，腸壁通透性增加112.7%，見(jiàn) Tab 3。

4 討論

實(shí)驗(yàn)采用在體單向灌流法和離體腸囊外翻法對(duì)田薊苷微乳的腸吸收進(jìn)行研究，并進(jìn)行方法學(xué)和腸壁吸附考察，結(jié)果表明:方法學(xué)穩(wěn)定、腸壁對(duì)微乳無(wú)吸附作用;微乳作為田薊苷載體，對(duì)其小腸吸收有明顯促進(jìn)作用，為微乳作為田薊苷載體可行性提供依據(jù)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，田薊苷是 P-gp等外排蛋白的底物，P-gp、BCRP對(duì)其具有外排作用，腸道是主要代謝場(chǎng)所。本實(shí)驗(yàn)所用微乳含 RH 40［8］，原因可能有:(1)抑制 P-gp、MRP20等的外排;(2)抑制CYP3A酶活性和腸道菌群代謝;(3)回腸微乳吸收最好，是營(yíng)養(yǎng)吸收主要腸段，存在大量淋巴小結(jié)，田薊苷通過(guò)微乳載帶選擇性趨向集合淋巴結(jié)，經(jīng) M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。且微乳表面張力低、粒徑小，易于透過(guò)細(xì)胞壁，藥物直接接觸腸上皮細(xì)胞，從而促進(jìn)吸收［9］。

Tab 3 Regression equation and Ke of tilianin ，tilianin ME with various consistence(n=6)

［1］馮長(zhǎng)根，李 瓊.香青蘭化學(xué)成分研究［J］.中成藥，2006，28(1):94－8.

［1］Feng C G，Li Q.Study on chemical of Dracocephalum moldavica L［J］.China Tradit Patent Med，2006，28(1):94 －8.

［2］吳 華，李景清，安文源，等.香青蘭藥材HPLC特征圖譜的研究［J］.藥物分析雜志，2009，29(7):1178－80.

［2］Wu H，Li J Q，An W Y，et al.Study on HPLC specific chromatogram of Dracocephalum moldavica L［J］.Chin J Pharm Anal，2009，29(7):1178－80.

［3］王婷婷，李 偉，袁 勇，等.大鼠單向灌流模型研究田薊苷的在體腸吸收［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38(7):12－5.

［3］Wang T T，Li W，Yuan Y，et al.Study on intestinal absorption of tilianin in rats of single-pass perfusion model［J］.China J Chin Mater Med，2013，38(7):12 －15.

［4］王新春，邢建國(guó)，袁 勇，等.田薊苷微乳組合物.中國(guó)，CN102860982A［P］.2013 －04 －17.

［4］Wang X C，Xing J G，Yuan Y，et al.Tilianin Microemulsion combination.China，CN102860982A［P］.2013 －04 －17.

［5］Yuan H Zhao，Michael H，Abraham，et al.Evaluation of rat intestinal absorption data and correlation with human intestinal absorption［J］.Eur J Med Chem，2003，38(3):233 －43.

［6］Sutton C S，Rinald T S，Vukovinsky K E，et al.Comparison of the gravimetric，phenol red ，and 14C-PEG-3350Methodsto determine water adsorption in rat single-pass intestinal perfution model［J］.AAPS Pharm Sci，2001，3:25 － 32.

［7］陳寶婷，徐福平，林愛(ài)華，劉奕明.翻轉(zhuǎn)腸囊法研究芒果苷在大鼠的腸吸收動(dòng)力學(xué)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(5):691－4.

［7］Chen B T，Xu F P，Lin A H，Liu Y M.Study on intestinal absorption of mangiferin by everted gut sacs model［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(5):691 －4.

［8］饒子超，斯陸勤，關(guān)延彬，等.含CremophorRH40的自微乳化給藥系統(tǒng)對(duì)大鼠體內(nèi) CYP3A酶的抑制作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(12):1535 －9.

［8］Rao Z C，Si L Q，Guan Y B，et al.Inhibitive effect of Gremophor RH40-based self-microemulsiflying drug delivery system on cytochrome P450 3A enzymes in rats［J］.Herald Med，2010，29(12):1535－9.

［9］葉海英，張忠義，高 申，等.法莫替丁微乳的研制及其質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(1):68 －70.

［9］Ye H Y，Zhang Z Y，Cao S，et al.Preparation of famotidine microemulsion and its quality evaluation［J］.J First Mil Med Univ，2003，23(1):68 －70.