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    無尾果黃酮類化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析※

    2017-09-13 06:52:04朱繼孝魏春華慕澤涇鐘國躍曾金祥
    中醫(yī)藥通報 2017年4期
    關(guān)鍵詞:分子離子負離子黃酮類

    ● 朱繼孝 文 樂 魏春華 慕澤涇 鐘國躍 曾金祥

    無尾果黃酮類化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析※

    ● 朱繼孝*文 樂 魏春華 慕澤涇 鐘國躍 曾金祥▲

    目的:通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對無尾果中的化學(xué)成分進行定性分析。方法:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS,YMC-ULtraHT Pro C18色譜柱(100 mm×3 mm,2μm)以甲醇-0.5%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫;質(zhì)譜采用電噴霧(ESI)離子源,在負離子模式下采集數(shù)據(jù),通過保留時間、精確分子離子峰和二級質(zhì)譜裂解碎片,對無尾果進行成分鑒定。結(jié)果:初步鑒定了無尾果中10個黃酮類成分。結(jié)論:UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鑒別無尾果中的黃酮類化學(xué)成分,該方法簡單、快速,結(jié)果準(zhǔn)確,為無尾果的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

    無尾果 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 化學(xué)成分 裂解規(guī)律 黃酮

    無尾果(ColurialongifoliaMaxim),藏藥名為熱袞巴,是薔薇科無尾果屬的植物,分布于中國大陸的甘肅、云南、西藏、四川、青海等地,全草入藥,有止血止痛、清熱作用。藏藥志記載,熱袞巴能治療高血壓引起的發(fā)燒、神經(jīng)性發(fā)燒、疝痛等,具有清熱解毒功效[1]。無尾果在藏區(qū)使用廣泛。目前國內(nèi)外對于無尾果化學(xué)成分的研究并不多見。本課題組前期對無尾果的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用進行了研究。前期研究結(jié)果表明,無尾果具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用,其抗炎作用與提高抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制炎癥因子TNF-α、PGE2的釋放有關(guān)。但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚,限制了無尾果的進一步開發(fā)與應(yīng)用。因此,建立一種有效、準(zhǔn)確的方法對無尾果進行化學(xué)成分研究具有重要意義。近年來,液質(zhì)聯(lián)用在中藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,已成為分離鑒定各種化合物的重要手段之一[2-3]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)彌補了傳統(tǒng)檢測器的不足,它集LC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體[4]。因此,本實驗以無尾果為研究對象,應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對無尾果甲醇提取物的化學(xué)成分進行研究,根據(jù)其準(zhǔn)分子離子以及二級碎片離子、文獻數(shù)據(jù)等鑒定無尾果的化學(xué)成分,并總結(jié)其質(zhì)譜裂解規(guī)律,為無尾果活性成分的鑒定和研究提供科學(xué)依據(jù),同時為藏藥化學(xué)成分的研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 儀器與材料

    1.1儀器島津LC-30A超高效液相色譜儀,PDA紫外檢測器;Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀,配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView數(shù)據(jù)處理軟件(A美國B SCIEX 公司);KQ-5200DB 型超聲清洗機(昆山市超聲波儀器公司);AL204 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司); Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國默克密理博公司)。

    1.2藥物與試劑異槲皮苷對照品(純度≥98%,批號:MUST-16051010)、金絲桃苷對照品(純度≥98%,批號:MUST-16032113)、木犀草素對照品(純度≥98%,批號:MUST-16011015)均購自成都曼思特生物科技公司;甲醇( HPLC 級,美國天地有限公司),甲酸( HPLC 級,山西西亞化工有限公司),水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水(美國Millipore 公司)。

    無尾果由課題組采自云南怒江貢山縣,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘囯躍研究員鑒定為薔薇科無尾果屬植物無尾果 (C.longigoliaMaxim)的干燥全草。

    2 方法

    2.1供試品溶液制備無尾果粉碎,稱取約2.0g置于50mL錐形瓶,加入25mL 75% 甲醇超聲提取45min,抽濾、旋干、定容至5mL容量瓶中,取定容后藥液過0.22μm 微孔濾膜過濾,供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

    2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備分別精密稱取2mg對照品(金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草素)于5mL容量瓶中,用75%甲醇溶解稀釋至刻度,過0.22μm微孔濾膜,待分析。

    2.3 LC-MS條件

    2.3.1 色譜條件 色譜柱:YMC-ULtraHT Pro C18 色譜柱(100 mm×3 mm,2μm);流動相:0.5%甲酸水溶液(A),甲醇(B),梯度洗脫:0~30min,8%~60% B;30~40min,60%~95% B;40~42min,95%~8% B;42~47min,8%~8% B;流速:0.4mL/min;柱溫:32℃;進樣量:4μL。

    2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI),負離子模式;質(zhì)量掃描范圍m/z100~1000;噴霧電壓:-4500V,霧化氣溫度:500℃,氣簾氣:140.745kPa,輔助氣:344.74 kPa;去簇電壓(DP):-100V;采用AB analyst TF軟件采集數(shù)據(jù),TOF/MS 一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時間分別為200、100 ms,碰撞能量CE為40eV,CES碰撞能量疊加為(40±10)eV。

    2.4數(shù)據(jù)處理采用AB Sciex公司 Peak View 1.6軟件,對UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數(shù)據(jù)進行處理。

    3 結(jié)果

    3.1無尾果化學(xué)成分分析采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 對75%甲醇提取無尾果藥材成分進行定性分析,(-) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)見圖1。應(yīng)用Peak View 1.6軟件分析75% 甲醇提取無尾果中各化學(xué)成分的保留時間及其質(zhì)譜信息,并結(jié)合分子離子峰與對照品、相關(guān)文獻報道數(shù)據(jù)進行對比,對其中的化學(xué)成分進行確認,初步鑒定出無尾果提取物中黃酮類化合物10個,見表1。

    圖1 無尾果提取物在負離子模式下總離子流圖

    PeaknoCompoundidentityFormulaRt(min)Error(ppm)FoundatMass(Da)Fragmentionsm/z1CatechinhydrateC15H14O68.974.4289.0712245.0826、203.0715、187.0398、161.06032HyperosideC21H20O1220.751463.0681301.0351、272.0322、255.0299、243.0294、178.9990、151.00463MiquelianinC21H18O1320.860.5477.0678301.0362、151.0052、178.99934Apigenin7-glucosideC21H20O1022.470.6431.0966311.0581、269.0454、225.0572、200.0450、5QuercetinC15H10O726.573.1301.0363273.0393、178.9981、151.00436LuteolinC15H10O627.752285.0410257.0450、229.0501、151.00467TilirosideC30H26O1328.230.6593.1304447.0940、327.0516、307.0829、285.0415、284.0332、255.0304、227.0351、163.04018KaempferolC15H10O629.821.6285.0399257.0562、257.0453、229.0311、211.0405、187.04209ApigeninC15H10O530.312.1269.0461241.0467、225.0548、201.0541、197.0445、159.045910IsorhamnetinC16H12O730.612.8315.0519300.0275、283.0245、151.0048

    3.2化合物的質(zhì)譜裂解特征化合物1tR為8.97min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z289.0712 [M-H]-,其分子式為C15H14O6,分子離子峰失去CO2得到碎片離子m/z245.0826,碎片離子m/z245.0826分別失去C2H2O、C3H6O得到碎片離子m/z203.0715、187.0398。碎片離子m/z203.0715失去C2H2O得到碎片離子m/z161.0603,裂解規(guī)律與文獻一致。因此,可以推測為兒茶素[5]。

    化合物2tR為20.75min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z463.0681 [M-H]-,其分子式為C21H20O12,二級圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品一致,二級圖譜碎片離子峰為m/z301.0351、300.0278、271.0246、255.0299、243.0294、178.9990、151.0046。根據(jù)二級碎片離子m/z301.0351、300.0278、272.0322、255.0290、243.0294、178.9990、151.0046推測為槲皮素母核,分子離子峰,m/z463.0681失去一分子葡萄糖得到m/z301.0351,而m/z301.0351強度高于m/z300.0278和碎片離子m/z271.0254、255.0299,可以推測糖連接在3位,見圖2a。因此,推測此化合物為金絲桃苷[6]。

    化合物3tR為20.86min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z477.0747[M-H]-,其分子式為C21H18O13,分子離子峰失去一分子葡萄糖醛酸得到碎片離子m/z301.0362,根據(jù)碎片離子m/z179.0344、151.0052、150.9874推測m/z301.0362為槲皮素母核。因此,推測化合物3為槲皮素-3-0葡萄糖醛酸,裂解規(guī)律與文獻一致[6]。

    化合物4tR為22.47 min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z431.0970 [M-H]-,其分子式為C21H20O10,分子離子峰失去C4H8O5得到碎片離子m/z311.0581,失去一分子葡萄糖得到碎片離子m/z269.0454。碎片離子m/z269.0454分別失去CO2和C3O2得到碎片離子m/z225.0572、200.0450,推測化合物4為芹菜素7-O-葡萄糖苷,裂解規(guī)律與文獻一致[7]。

    化合物5tR為26.57 min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.0363 [M-H]-,其分子式為C15H10O7,分子離子峰m/z301.0363 分別失去CO、C7H6O2得到碎片離子m/z273.0405、178.9982,碎片離子m/z178.9982失去CO得到碎片離子m/z151.0042,推測此化合物為槲皮素,裂解規(guī)律與文獻一致[8]。

    化合物6tR為27.75 min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z285.0399 [M-H]-,其分子式為C15H10O6,二級圖譜與對照品一致,分子離子峰失去CO得到碎片離子m/z257.0562,碎片離子m/z257.0450失去CO得到碎片離子m/z229.0509。碎片離子m/z285.0399發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z151.0051、133.0291,推測此化合物為木犀草素,見圖2b,裂解規(guī)律與文獻一致[9]。

    化合物7tR為28.23min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z593.1304 [M-H]-,其分子式為C30H26O13,碎片離子峰為m/z447.0940、327.0516、307.0829、285.0415、284.0332、255.0304、227.0351、145.0296,分子離子脫去C9H6O2得到碎片離子447.0940,碎片離子m/z447.0940進一步脫去C6H10O5產(chǎn)生碎片離子m/z285.0415,推測中性丟失為葡糖糖基。由碎片離子m/z285.0415、284.0332、255.0304、227.0351可以推斷為山奈酚母核。因此,推測此化合物為銀鍛苷[9]。

    a 金絲桃苷

    b 木犀草素

    c芹菜素

    化合物8tR為29.82min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z285.0399 [M-H]-,其分子式為C15H10O6,分子離子峰m/z285.0399分別失去CO、C4H4O3得到碎片離子m/z257.0450、187.0395,碎片離子m/z257.0450分別失去CO和HCOOH得到碎片離子m/z229.0501、211.0395,推測化合物8為山奈酚,裂解規(guī)律與文獻一致[10]。

    化合物9tR為30.31min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z269.0405[M-H]-,其分子式為C15H10O5,分子離子峰m/z269.0405分別失去CO、CO2、C3O2、C2O3得到碎片離子m/z241.0467、225.0548、201.0541、197.0445,碎片離子m/z201.0541失去C2H2O得到碎片離子m/z159.0459,見圖2c,推測化合物9為芹菜素,裂解規(guī)律與文獻一致[11]。

    化合物10tR為30.61min,負離子模式下,高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z315.2549 [M-H]-,其分子式為C16H12O7,分子離子峰m/z315.2549失去CH3得到m/z300.0275,碎片離子m/z300.0275失去H2O得到碎片離子m/z283.0246,先失去C7H6O再失去CO得到碎片離子m/z151.0048,推測化合物10為異鼠李素,裂解規(guī)律與文獻一致[12]。

    4 討論

    藏藥具有療效明顯、毒副作用小、資源豐富易得等優(yōu)點,屬我國較有影響、較為完整的民族藥之一。而無尾果化學(xué)成分相關(guān)的報道仍屬空白。

    UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)為化合物的鑒定提供了一種全新方法,與傳統(tǒng)化學(xué)成分分離鑒別方法相比操作簡便、快速、準(zhǔn)確,已成為中藥藥效成分發(fā)現(xiàn)與鑒別的有力工具。本實驗分析了無尾果甲醇提取物成分的質(zhì)譜行為,鑒別了10種黃酮類化合物。并進一步發(fā)現(xiàn)以槲皮素為母核的化合物如槲皮素-3-0葡萄糖醛酸、金絲桃苷,其特征碎片離子為m/z301;芹菜素,其特征碎片離子為m/z269;木犀草素,其特征碎片離子為m/z285,為后續(xù)黃酮類化合物的鑒別提供了參考依據(jù)。

    黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、抗病毒等活性[13],如金絲桃苷具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用且通過抑制NF-κB的活化產(chǎn)生抗炎作用[14];木犀草素具有抗炎鎮(zhèn)痛保護神經(jīng)的作用,其能降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性,減少促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[15]。這表明本實驗推斷出的黃酮類化合物,在一定程度上闡明了無尾果的抗炎鎮(zhèn)痛藥效成分,為無尾果的藥理活性乃至質(zhì)量控制提供了初步物質(zhì)依據(jù)。從總離子流圖可以看出,仍有大量成分尚待進一步解析,說明無尾果可能還存在其它抗炎鎮(zhèn)痛藥效成分,相關(guān)工作正在進行之中。

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    江西民族藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目(No.JXXT201402021)

    朱繼孝,男,副教授,碩士研究生導(dǎo)師。研究方向:中藥與民族藥有效成分與作用機理。

    ▲通訊作者曾金祥,男,副教授,碩士研究生導(dǎo)師。研究方向:中藥與民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Email:zjinxiang@163.com

    江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心(330004)

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