多藥耐藥相關蛋白在食管鱗癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶中的差異表達及意義

方強 董丹丹 楊紅 任光國 韓泳濤 肖波

1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，四川 成都610041；

2.四川省人民醫(yī)院病理科，四川 成都610072

研究表明，食管癌根治術后輔助化療能明顯延長T3、T4和淋巴結陽性患者的無病生存時間，且有可能提高生存率［1-4］。因此，術后輔助化療是綜合治療的重要環(huán)節(jié)之一。食管癌根治術后輔助化療主要針對淋巴結轉移灶，但轉移灶中腫瘤細胞群多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的異質(zhì)性是影響化療效果的主要因素［5］。目前有關食管鱗癌MDR的研究多限于腫瘤原發(fā)灶［6-8］，其原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR是否存在異質(zhì)性鮮見報道。本研究通過比較食管胸段鱗癌患者原發(fā)灶及相應淋巴結轉移灶MDR相關蛋白肺耐藥相關蛋白(LRP)、P-糖蛋白(P-gp)、拓撲異構酶Ⅱ(TOPO-Ⅱ)、胸甘酸合成酶(TS)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST-π)表達程度的差異，為食管鱗癌根治術后選擇合理化療方案的提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇四川省腫瘤醫(yī)院胸外科2008年7月—2010年8月行食管次全切除及二野或三野淋巴結清掃術、經(jīng)病理學檢查證實為伴淋巴結轉移的食管胸段鱗癌患者54例，男性47例，女性7例，年齡42～71歲，中位年齡59歲，其中低分化鱗癌25例，中分化鱗癌16例，高分化鱗癌13例，所有患者術前均未行放、化療。轉移淋巴結位于隆突下7例，左喉返神經(jīng)旁7例，右喉返神經(jīng)旁8例，病灶旁5例，胸導管旁2例，賁門旁6例，胃左血管旁11例，頸部5例，奇靜脈弓旁1例，下段食管旁2例(表1)。

表1 54例食管胸段鱗癌的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics in 54 esophageal squamous cell carcinoma patients

1.2 試劑與方法

每例腫瘤原發(fā)灶、相應的轉移淋巴結標本均經(jīng)4%甲醛溶液固定、櫻花VIP-E300F全自動組織脫水機處理，用Leica 2245型輪轉式石蠟切片機制作石蠟標本，切片厚4 μm。即用型抗LRP、P-gp、TopoⅡ、TS、GST-π單克隆抗體均為美國Neomarker公司產(chǎn)品，購于北京中杉金橋生物試劑公司和福州邁新生物試劑公司。采用免疫組化LDP法進行切片標記，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 結果判斷

1.3.1 陽性反應及定位

LRP、P-gp、TS、GST-π表達定位于細胞質(zhì)(LRP、TS、GST)或細胞膜(P-gp)，癌細胞胞質(zhì)內(nèi)或胞膜上(P-gp)出現(xiàn)均質(zhì)狀、顆粒狀或線條狀的棕黃色信號為陽性反應，TopoⅡ的表達定位于細胞核，癌細胞胞核內(nèi)出現(xiàn)黃或棕黃色信號為陽性反應。

1.3.2 結果判斷

隨機觀察10個高倍視野，癌細胞陽性數(shù)量占總計數(shù)細胞的百分比即為各抗體在癌灶標本中的表達率。結合切片內(nèi)癌細胞陽性細胞百分比與陽性細胞的信號強度，將結果分為無表達(-)：切片中無陽性腫瘤細胞，未見陽性信號；低度表達(+)：腫瘤陽性細胞數(shù)＜25%，陽性信號弱；中度表達(++)：腫瘤陽性細胞數(shù)25%～50%，陽性信號較強；高度表達(+++)：腫瘤陽性細胞數(shù)＞50%，陽性信號極強。每張切片由2位病理專家分別獨自分析，最后判斷取2位病理專家分析結果的平均值。每例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結轉移灶所測同一MDR相關蛋白的表達結果不相同，即記為不一致，表達不一致的總例數(shù)/總病例數(shù)(54例)就是一種MDR相關蛋白的表達不一致率。同樣，對于檢測結果對耐藥的提示每例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結轉移灶不相同，即為耐藥不一致，耐藥不一致的總例數(shù)/總病例數(shù)(54例)就是一種MDR相關蛋白的耐藥不一致率。

1.4 檢測結果對耐藥的提示

LRP、P-gp、TS、GST-π表達(++/+++)提示腫瘤對化療藥物耐藥，表達(-/+)提示腫瘤對化療藥物敏感。Topo-Ⅱ表達(-/+)提示腫瘤對化療藥物耐藥，表達(++/+++)提示腫瘤對化療藥物敏感。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。原發(fā)灶與淋巴結轉移灶的MDR相關蛋白表達比較采用Wilcoxon signedrank test，MDR相關蛋白表達與組織分化程度分析采用Kruskal Wallis test，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的異質(zhì)性

腫瘤原發(fā)灶與淋巴結轉移灶LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ、GST-π表達和耐藥不一致率分別為63.0%和26.9%、42.6%和22.2%、48.1%和25.9%、50.0%和29.6%、18.5%和1.9%。LRP在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。其余4種蛋白在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶的表達沒有差異，GST-π在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶中均表達(表2、3，圖1、2)。

2.2 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的異質(zhì)性與與組織分化程度的關系

Kruskal Wallis test結果顯示，腫瘤原發(fā)灶、淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的異質(zhì)性與組織分化程度無關(表4)。

圖1 食管鱗癌原發(fā)灶MDR蛋白的表達Fig.1 The expression of multidrug-resistant (MDR) proteins in primary tumors in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients(×100)

表2 食管胸段鱗癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達差異性變化Tab.2 The heterogenous expression of MDR associated proteins in primary tumors and metastatic lymph nodes in patients with esophageal squamous cell

表3 食管胸段鱗癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的異質(zhì)性Tab.3 Comparison of the MDR associated protein expression levels between primary ESCC tumors and metastasized lymph nodes[n(%)]

表4 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的異質(zhì)性與組織分化程度的關系Tab.4 Associations of MDR associated protein expression in primary tumors and lymph nodes based on degree of differentiation[n(%)]

圖2 食管鱗癌淋巴結轉移灶MDR蛋白的表達Fig.2 The expression of MDR proteins in metastatic lymph nodes in patients diagnosed with ESCC (×100)

3 討 論

臨床上接受根治術的食管胸段鱗癌患者多屬中晚期，淋巴結轉移率高，成為影響預后的主要因素［9］。目前研究表明，食管癌根治術后輔助化療，雖然沒有明顯提高總生存率，但在有淋巴結轉移的患者中有改善生存時間的趨勢。國內(nèi)的研究結果顯示，術后輔助化療提高了有淋巴結轉移的食管癌患者生存率［10-11］。因此術后輔助化療仍是延長食管癌患者術后生存時間的重要環(huán)節(jié)。然而臨床結果也顯示，術后輔助化療在一部分患者中并未有效控制術后淋巴結轉移，即耐藥是困擾食管癌化療的關鍵性難題?？鼓[瘤藥物的耐藥現(xiàn)象可能是自然發(fā)生或是獲得性的。我們推測，食管癌淋巴結轉移灶中腫瘤細胞群MDR的異質(zhì)性變化可能是影響術后輔助化療效果的一個重要機制。

目前對消化道惡性腫瘤淋巴結轉移灶MDR異質(zhì)性的研究結果表明，胃癌、大腸癌的淋巴結轉移灶確實存在MDR異質(zhì)性的變化，原發(fā)灶的耐藥基因相關蛋白表達水平不能預測淋巴結轉移灶的MDR［12-13］。對乳腺癌原發(fā)灶與相應腋窩淋巴結轉移灶的分子遺傳學研究也發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象［14］。但對食管胸段鱗癌淋巴結轉移灶MDR異質(zhì)性的研究目前鮮見報道。本研究結果顯示，食管胸段鱗癌原發(fā)灶與相應的淋巴結轉移灶LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ、GST-π表達和耐藥不一致率分別為63.0%和26.9%、42.6%和22.2%、48.1%和25.9%、50.0%和29.6%、18.5%和1.9%。雖然只有LRP在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)，但仍表明食管鱗癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶存在MDR的異質(zhì)性變化。本研究結果還顯示，與胃癌、大腸癌兩種消化道腺癌不同，食管鱗癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達的差異性與組織分化程度無關。

有關消化道惡性腫瘤原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR異質(zhì)性研究的文獻中是通過比較MDR相關蛋白表達水平的差別來分析結果的。由于在免疫組化結果判斷中無表達(-)與低度表達(+)，中度表達(++)與高度表達(+++)雖然表達水平有差別，但在耐藥的提示意義上是一致的，因此檢測結果對耐藥的提示才能更好反映耐藥性的差異性。本研究結果顯示，雖然原發(fā)灶與相應的淋巴結轉移灶MDR耐藥不一致率均比表達不一致率低，但除GST-π外，LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ耐藥不一致率并不低，均在20%～30%之間，表明原發(fā)灶的MDR不能預測淋巴結轉移灶的MDR。

為了提高治療效果和探索新的方案，目前臨床上有更多的新藥引入食管鱗癌的化療，對傳統(tǒng)經(jīng)典的順鉑聯(lián)合5-FU方案有取代的趨向。本研究中對反映鉑制劑、植物堿類藥物敏感性的LRP和反映5-FU敏感性的TS的檢測結果顯示，大多數(shù)腫瘤原發(fā)灶與淋巴結轉移灶對上述藥物是敏感的，說明傳統(tǒng)經(jīng)典的順鉑聯(lián)合5-FU方案總體上是有效的。值得注意的是，從LRP的結果來看，淋巴結轉移灶比原發(fā)灶更敏感，因此當檢測原發(fā)灶提示耐藥時，仍有必要檢測淋巴結轉移灶。本研究對P-gp檢測的結果顯示腫瘤原發(fā)灶與淋巴結轉移灶總體上對紫杉醇、長春堿類藥物敏感，而TOPO-Ⅱ的檢測結果反映出腫瘤原發(fā)灶與淋巴結轉移灶總體上對伊立替康不敏感。GST-π在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶中均表達且主要是中高度表達，提示對于反映此類機制的藥物如環(huán)磷酰胺、氮芥、瘤可寧類藥物均不適合。綜上所述，食管鱗癌存在原發(fā)灶與淋巴結轉移灶MDR的異質(zhì)性現(xiàn)象，僅檢測原發(fā)灶MDR相關蛋白水平難以反映淋巴結轉移灶或微轉移灶的MDR。食管癌根治術后影響遠期療效的主要原因之一是淋巴結轉移，因此術后輔助化療主要針對淋巴結轉移灶，檢測淋巴結轉移灶MDR相關蛋白表達水平有助于指導食管鱗癌術后選擇合理化療方案，從而可提高術后輔助化療效果。

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