多能成體祖細(xì)胞培養(yǎng)條件促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)功能

婁慧 徐國旭

干細(xì)胞技術(shù)的迅速發(fā)展為攻克許多目前無法治療的疾病帶來新的希望。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ESC）、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（inducible pluripotent stem cell,iPSC）以及各種成體干細(xì)胞（adult stem cells,ASCs）各有特點(diǎn)，在細(xì)胞替代治療以及組織工程材料制備中均顯示出很好的應(yīng)用前景[1-3]。ASCs已經(jīng)開始用于血液系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病以及皮膚損傷的治療[4-6]。與ESC和iPSC相比，ASCs具有更多的優(yōu)勢。

首先，大多研究表明ASCs移植是安全的，而且自體ASCs移植被臨床實(shí)踐證明是可行的[8-10]。其次，從取材和細(xì)胞性質(zhì)看，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）、脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）和血液中的細(xì)胞最為可行，因?yàn)閷儆跈C(jī)體可再生或廢棄的組織。第三，從療效看，已有研究證明BMMSCs和ADSCs都能被誘導(dǎo)分化為不同的組織細(xì)胞，跨系、甚至跨胚層分化為其它類型組織細(xì)胞[11-14]。有研究表明，ADSCs具有向光感受器細(xì)胞和膠質(zhì)樣細(xì)胞分化的能力，并表現(xiàn)出修復(fù)血視網(wǎng)膜屏障（BRB）的作用[15]。目前，用于動物疾病模型干預(yù)的ASCs多為P3-P5代，因?yàn)锳SCs體外培養(yǎng)長期傳代會出現(xiàn)老化，這也是ASC臨床研究中需要解決的關(guān)鍵問題。

Jiang等[16]采用一種新的培養(yǎng)基從骨髓間充質(zhì)中分離出具有更強(qiáng)增殖能力和更廣泛分化潛能的細(xì)胞，即骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cell,MAPC）。與BMMSCs相比，MAPC具有相同的體外成脂、成骨和成軟骨的分化效率，但具有更強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力[17]；更為重要的是MAPC不會形成畸胎瘤[16]。因而，MAPC對于治療退行性和遺傳性疾病，如視網(wǎng)膜變性疾病帶來巨大的希望。

以年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）和視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）為主要代表的視網(wǎng)膜變性疾?。╠egenerative retinal diseases,DRD）是眼科主要的致盲性疾病之一。其主要的病理特征是視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞（Photoreceptor）和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium,RPE）凋亡及功能喪失而引起視功能損害[18-19]。目前還缺乏針對這種疾病的有效治療手段。

本課題擬利用MAPC的培養(yǎng)基培養(yǎng)猴BMMSCs和人脂肪干細(xì)胞（hADSCs），檢測MAPC培養(yǎng)條件對這兩種細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特征的影響，并將經(jīng)MAPC培養(yǎng)條件培養(yǎng)的hADSCs移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔并重點(diǎn)檢測其保護(hù)效應(yīng)，驗(yàn)證MAPC培養(yǎng)條件是否能增強(qiáng)ADSCs的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用，為MAPC最終走向臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.試劑：淋巴細(xì)胞分離液購自Corning，100×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（ITS）、亞油酸蛋白、地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸、MCDB-201培養(yǎng)液、β-磷酸甘油、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、L-抗壞血酸、抗壞血酸-2-磷酸以及表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）購自Sigma-Aldrich公司,血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor,PDGF）購自R&D Systems Inc公司，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）購自 Peprotech 公司。其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Invitrogen公司，RNAiso Plus和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TakaRa公司，Sybrgreen real time premix購自天根生化，常規(guī)生化試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動物：皇家外科學(xué)院（royal college of durgeons,RCS）大鼠是遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動物模型。RCS大鼠由于隱性Mertk基因突變致使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞喪失吞噬視細(xì)胞外節(jié)膜盤能力而導(dǎo)致視細(xì)胞外節(jié)膜盤堆積，最終導(dǎo)致光感受器細(xì)胞進(jìn)行性變性和丟失。RCS大鼠飼養(yǎng)在同濟(jì)大學(xué)動物中心，并遵循同濟(jì)大學(xué)動物中心和眼科與視覺科學(xué)研究協(xié)會（the Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO)關(guān)于動物使用和處理的規(guī)定。

實(shí)驗(yàn)用食蟹猴骨髓由昭衍蘇州新藥研究中心有限公司提供。

二、方法

1.食蟹猴BMMSCs的分離制備及MAPC培養(yǎng)條件培養(yǎng)：新鮮抽取的食蟹猴骨髓3ml轉(zhuǎn)移到抗凝管中，800×g離心5min；棄去血漿后剩余血細(xì)胞用含抗生素的PBS清洗2遍，細(xì)胞用4ml PBS重懸，再加到8ml淋巴細(xì)胞分離液上，800×g離心0.5 h。此時(shí)細(xì)胞富集于淋巴細(xì)胞分離液和PBS之間，吸取中間層的骨髓細(xì)胞，用PBS清洗2遍，接種于培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞長至80﹪匯合后，以1:3傳代，分別用DMEM/LG-20﹪FBS培養(yǎng)液和MAPC培養(yǎng)液培養(yǎng)。

MAPC培養(yǎng)液：含60﹪DMEM/LG（低糖）培養(yǎng)液、40﹪ MCDB-201培養(yǎng)液、1 nmol/L地塞米松、10-4M L-抗壞血酸、1×ITS、4.7 μg/ml亞油酸蛋白、1﹪青霉素-鏈霉素、2﹪血清、10 ng/ml PDGF和10 ng/ml EGF。

2.hADSCs分離制備及MAPC培養(yǎng)條件培養(yǎng)：新鮮獲取的脂肪組織用含抗生素的PBS充分沖洗，用1 g/L的膠原酶37℃條件消化60min，加入等體積含血清的培液用以中和膠原酶，300×g離心5min；將細(xì)胞沉淀物用DMEM/LG培養(yǎng)液重懸并接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長至80﹪匯合后以1:3傳代，分別采用含10﹪FBS的DMEM/LG培養(yǎng)液和MAPC培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代[16]，兩種培養(yǎng)條件下的hADSCs分別定義為DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC。

3.成骨、成脂及成軟骨分化實(shí)驗(yàn)：取P4代的DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC，均以104/cm2接種于12孔板中。待細(xì)胞長至80﹪匯合時(shí)更換脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基或成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)3周。分化成的脂肪細(xì)胞用油紅染色鑒定，成骨細(xì)胞用茜素紅染色鑒定。誘導(dǎo)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化時(shí)，細(xì)胞以5×105個(gè) /100μl懸滴培養(yǎng) 1d，待細(xì)胞形成懸球，將細(xì)胞球轉(zhuǎn)移至細(xì)菌培養(yǎng)皿中，用軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換液，3周后采用4﹪多聚甲醛固定，制備冰凍切片，用甲苯胺藍(lán)染色鑒定。

脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基：0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、1mmol/L地塞米松、10mmol/L胰島素、200mmol/L吲哚美辛。

成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基：0.1mmol/L地塞米松、50mmol/L抗壞血酸-2-磷酸、10mmol/L β-磷酸甘油。

軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基：6.25 mg/ml胰島素、10 ng/ml轉(zhuǎn)化生長 因 子 β1、50 nmol/L 抗壞血酸-2-磷酸。

4.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：分別將DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC（P4）接種于96孔板（500個(gè) /孔 /100μl），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。檢測時(shí)，每孔加入10μl MTT，37℃放置4 h后加入100μl三聯(lián)劑，隔天檢測OD值（波長570 nm）。三聯(lián)劑成分：異丙醇5ml，10 M HCl 0.1ml鹽酸，再10﹪SDS定容至100ml。

5.定量PCR分析：PCR分析所使用的引物均在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。收取DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC（P4），加入1ml Total RNA 提取試劑，按照說明書進(jìn)行操作。RNA定量后，取1000 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再稀釋至10 ng/μl。定量PCR分析MSC標(biāo)記分子、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的基因表達(dá)水平。

6.克隆形成率實(shí)驗(yàn)：將DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC（P4）接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（100個(gè)細(xì)胞/皿），培養(yǎng)10d。然后棄除培養(yǎng)液，4﹪多聚甲醛固定10min，用吉姆薩染色鑒定。

7.細(xì)胞移植：選取21d日齡的RCS大鼠，分為DMEM/LG-hADSC移植組，MAPC-hADSC移植組，0.9﹪ NaCl注射組和未處理組，每組6只老大鼠。將DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSC（P4）消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/μl。移植時(shí)，取約3μl的細(xì)胞懸液注射到3W的RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔。

8.TUNEL檢測：細(xì)胞移植3周后，取下RCS大鼠眼球固定并制備成冰凍切片。PBS水化10min，0.25﹪ TritonX-100透膜30min，PBS洗3次，每次5min。用TUNEL試劑染色，37℃溫育 1h，PBS洗 3次，每次 5min；DAPI染色2min，PBS洗3次，每次5min，封片并拍照。

9.ERG檢測：細(xì)胞移植3周后，對RCS大鼠經(jīng)暗適應(yīng)后在弱紅光下進(jìn)行ERG檢測。未進(jìn)行細(xì)胞移植的RCS大鼠（出生后6周）作為對照。ERG用視覺電生理檢測儀（重慶康華瑞明公司制造）檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SigmaStat 3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ERG數(shù)據(jù)（b波值）以表示。DMEM/LG-hADSC移植組和MAPC-hADSC移植組兩組間b波值采用兩樣本t檢驗(yàn)；基因表達(dá)變化量用ΔΔct法計(jì)算，并用兩樣本t檢驗(yàn)檢測基因表達(dá)倍數(shù)的差異。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MAPC培養(yǎng)條件對于猴BMMSCs細(xì)胞增殖的影響

猴BMMSCs在DMEM/LG培養(yǎng)至P4，換為MAPC培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。在最初MAPC培養(yǎng)條件傳代1-2代時(shí)，這些猴BMMSCs形態(tài)變小，部分呈三角形狀，細(xì)胞增殖明顯增加，與BMMSCs培養(yǎng)條件下的猴BMMSCs相比，增加40﹪～50﹪。但這種形態(tài)、增殖性質(zhì)的改變僅維持2代。傳2代后，MAPC培養(yǎng)液培養(yǎng)的猴BMMSCs形態(tài)逐漸呈寬大扁平狀，超過在DMEM/LG標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)的相同代數(shù)的BMMSCs的大?。▓D1），提示MAPC培養(yǎng)條件在短期（2代以內(nèi)）內(nèi)能提高猴BMMSCs的增殖，2代以后則加速這些BMMSCs的老化。

二、MAPC培養(yǎng)條件對hADSCs形態(tài)和分化潛能的影響

在常規(guī)hADSCs的培養(yǎng)基DMEM-LG培養(yǎng)條件下，隨著傳代次數(shù)增加，hADSCs變扁平寬大的細(xì)胞比率增加（圖2）；而在MAPC培養(yǎng)條件下，hADSCs連續(xù)傳代至第10代，細(xì)胞形態(tài)仍保持不變（圖2），與DMEM/LG-hADSC一樣，MAPC-hADSC依然具有三系分化的潛能（圖3）。同 DMEM/LG-hADSC相 比，MAPC-hADSC的增殖力在培養(yǎng)的第6天和第8天有顯著性增加（P < 0.05，圖4a），并能形成更多更大的克隆（圖4b、c，第 10 代）。

表1 引物序列

圖1 倒置顯微鏡下觀察MAPC培養(yǎng)條件對猴BM-MSC的影響（×100）

圖2 倒置顯微鏡下觀察MAPC培養(yǎng)條件對hADSC生物特性的影響（×100）

圖3 倒置顯微鏡下觀察DMEM/LG-hADSC和MAPC-hADSCs的三系分化能力檢測

三、MAPC培養(yǎng)條件對hADSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的影響

在MAPC培養(yǎng)條件下，檢測了hADSCs(P4)細(xì)胞表面CD標(biāo)記物的基因表達(dá)，與DMEMLG培養(yǎng)條件的相同代數(shù)的細(xì)胞相比，MAPC培養(yǎng)條件對CD44基因表達(dá)沒有顯著性影響，CD140b、CD90、CD47的基因表達(dá)量分別升高了 2.03±0.21 倍、2.13±0.62 倍 和1.74±0.16 倍（P < 0.05）。CD105、CD73的基因表達(dá)量分別下降了 0.13±0.01 倍和0.28±0.09 倍（P < 0.01，圖5a）。同時(shí)，MAPC培養(yǎng)條件還影響細(xì)胞因子的基因表達(dá)。PEDF和HGF的基因表達(dá)量分別升高了 4.42±0.53 倍和8.55±2.13 倍（P < 0.01），IL-6的基因表達(dá)量下降了 0.13±0.009倍（P < 0.01）（圖5b、c、d）。同時(shí)，MAPC培養(yǎng)條件還能顯著上調(diào)PEDF和HGF的表達(dá)（P < 0.01）、顯著下調(diào)IL-6的表達(dá)（P < 0.01）（圖 5b、c、d）。這些作用提示，MAPC-hADSC具有更好的免疫耐受和更強(qiáng)的組織細(xì)胞營養(yǎng)作用。

圖4 MAPC培養(yǎng)條件增強(qiáng)hADSC的增殖能力和克隆形成能力

四、MAPC-hADSC對RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用

在RCS大鼠出生后3周，取MAPC-hADSC進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔移植。移植細(xì)胞3周后，用ERG檢查視網(wǎng)膜功能。結(jié)果表明，未接受細(xì)胞移植的對照組RCS大鼠的ERG的b波波幅比正常野生型大鼠（數(shù)據(jù)未顯示）顯著降低，相比之下，接受DMEM/LG-hADSC移植大鼠的b波波幅顯著高于對照組和注射氯化鈉組，而移植MAPC-hADSC 的大鼠b波波幅（239.621±15μV）高于DMEM/LG-hADSC 移 植組（189.4±22μV）（圖6），表明其視覺功能會明顯改善。視網(wǎng)膜組織學(xué)檢查表明，對照組RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層（outer nuclear layer,ONL）的厚度明顯變薄，并且外核層中TUNEL陽性細(xì)胞非常顯著地增加。相比之下，在接受MAPC-hADSC和DMEM/LG-hADSC移植的RCS大鼠，視網(wǎng)膜ONL厚度顯著大于對照RCS大鼠和氯化鈉注射組，而且ONL層中TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞顯著減少（圖7）。形態(tài)和功能性檢查結(jié)果一致提示相比較于DMEM/LG-hADSC、MAPC-hADSC具有更強(qiáng)的視網(wǎng)膜保護(hù)作用。

圖5 MAPC培養(yǎng)條件對hADSC表面標(biāo)記物和細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

圖6 MAPC-hADSC對RCS大鼠視網(wǎng)膜具有更強(qiáng)的保護(hù)作用

圖7 蔡司正置熒光顯微鏡下觀察hADSC移植抑制RCS大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡(×400)

討 論

視網(wǎng)膜變性疾病，如AMD、RP等，對人們視力損傷嚴(yán)重且目前缺乏有效治療措施。基于干細(xì)胞的細(xì)胞移植治療為干預(yù)這類疾病提供了新的希望。盡管干細(xì)胞研究時(shí)間尚短，但其快速進(jìn)展已使這種治療開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)。相對治療其他組織器官疾病的干細(xì)胞移植治療，眼病，特別是視網(wǎng)膜退行性疾病是干細(xì)胞治療的理想切入點(diǎn)。眼睛是一個(gè)免疫豁免器官、體積?。ㄒ浦菜韫w細(xì)胞數(shù)量較少）、移植可在直視下手術(shù)操作、其治療效果可以通過ERG等功能學(xué)檢測方法進(jìn)行評價(jià)。已有臨床研究證實(shí)，移植RPE細(xì)胞能改善視網(wǎng)膜功能[20]。在RCS模型中移植BMMSCs能抑制光感受器細(xì)胞的丟失，保護(hù)視網(wǎng)膜功能[21]。

本研究中用MAPC培養(yǎng)條件培養(yǎng)猴BMMSCs和hADSCs，希望能獲得可用于臨床的，如治療視網(wǎng)膜變性的供體細(xì)胞。盡管BMMSCs和ADSCs都屬于臨床上常見的ASCs，且兩者具有很多相同的生物學(xué)性質(zhì)，但本研究表明，兩者的細(xì)胞生物學(xué)特性還存在很多差異，包括在同樣的MAPC培養(yǎng)液條件下兩者的增殖特性及功能改變等反應(yīng)的顯著不同。在同樣的MAPC培養(yǎng)條件下，猴BMMSCs短期（2代）內(nèi)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，但隨后很快出現(xiàn)老化征象。這樣的變化不僅與hADSCs的反應(yīng)不同，與人BMMSCs的反應(yīng)也截然不同，后者出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞樣的表型[17]。推測這種不同反應(yīng)既與兩種細(xì)胞的種屬差異有關(guān)，也與組織差異有關(guān)。至少可以說，MAPC培養(yǎng)條件不適合用于猴BMMSCs的擴(kuò)增。

與BMMSCs相比，體外培養(yǎng)的ADSCs的遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定性可以保持更長時(shí)間[22],也具更高的增殖速率及更低的老化速率[23]。在本研究中的MAPC培養(yǎng)條件下，hADSCs比在常規(guī)的DMEM-LG培養(yǎng)條件下保持了更好的穩(wěn)定性和改善的增殖能力，在連續(xù)傳代至第10代時(shí)細(xì)胞形態(tài)仍保持不變，且依然具有三系分化潛能（圖2D）。同時(shí)，MAPC培養(yǎng)條件處理的hADSCs的增殖力在第6天和第8天有顯著性增加（P < 0.05，圖2B），并能形成更多更大的克?。▓D2C）。表明MAPC培養(yǎng)條件能更好地維持ADSCs的體外增殖能力，更適合ADSCs的擴(kuò)增。

在免疫表型方面，研究也表明ADSCs與BMMSCs有所不同。新鮮分離的ADSCs中，有部分細(xì)胞表達(dá)CD34，而BMMSCs不表達(dá)CD34；反過來，ADSCs不表達(dá)CD106，而BMMSCs則高表達(dá)CD106[24]。更為重要的是ADSCs比BMMSCs具有更強(qiáng)的免疫抑制功能[25]。最近文獻(xiàn)報(bào)道ADSCs在體內(nèi)外都支持血液穩(wěn)態(tài)，且活性甚至超過BMMSCs[26]，使得ADSCs越來越受到關(guān)注。本研究進(jìn)一步豐富了這方面的認(rèn)識。與常規(guī)ADSCs培養(yǎng)條件相比，MAPC培養(yǎng)條件處理的hADSCs在形態(tài)上沒有明顯變化，但在分子水平，不論是細(xì)胞表面標(biāo)記物還是細(xì)胞因子都發(fā)生了顯著變化，主要表現(xiàn)為CD73和CD105顯著下調(diào)、CD140b、CD90和CD47顯著上調(diào)；IL-6表達(dá)顯著下調(diào)、PEDF和HGF表達(dá)顯著上調(diào)。在MSC的CD標(biāo)記物中，CD73在低氧時(shí)對血管滲漏具有重要的作用[27]，CD105也是與血管生成密切相關(guān)的低氧誘導(dǎo)蛋白[28]。因此，可以推測：經(jīng)過MAPC培養(yǎng)條件的處理，hADSCs的血管生成能力可能會受到影響，但實(shí)際情形還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。另一組指標(biāo)中，hADSCs的CD90表達(dá)增高，可能意味著這種細(xì)胞干預(yù)會改善其免疫抑制活性或改善局部免疫平衡。因?yàn)镃D90表達(dá)降低已被證明與免疫抑制活性丟失有關(guān)[29]。而CD47表達(dá)增加則與細(xì)胞吞噬能力降低有關(guān)。有研究表明，在巨噬細(xì)胞通過吞噬作用清除血液中病原菌和損傷的衰老細(xì)胞過程中，細(xì)胞表面的CD47能與巨噬細(xì)胞的受體SIRPa結(jié)合[30],負(fù)調(diào)控吞噬作用，從而抑制正常細(xì)胞的吞噬功能[31]。移植的紅細(xì)胞[32]、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞[33]則因缺乏自主表達(dá)CD47而常會被吞噬，從另一方面證明了CD47可作為“不要吃我（don’t eat me）”信號以確保自體細(xì)胞不被吞噬。整合這些研究報(bào)告和在本研究中MAPC培養(yǎng)條件下hADSCs的CD47表達(dá)明顯上調(diào)，支持這種移植細(xì)胞具有更強(qiáng)的對抗被吞噬的能力，從而能理解為什么移植的hADSCs能更好地存活。

作為ADSCs表達(dá)的主要細(xì)胞因子，在MAPC培養(yǎng)條件下，hADSCs的PEDF和HGF表達(dá)顯著升高、IL-6表達(dá)顯著降低。以往研究表明：PEDF具有多種功能，包括抗血管生成、抗腫瘤和神經(jīng)營養(yǎng)性質(zhì)[34]。人視網(wǎng)膜中PEDF的表達(dá)出現(xiàn)在胚胎早期，表明它在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化中可能起重要作用[35]；HGF則作為主要作用于上皮來源細(xì)胞的一種多功能的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、運(yùn)動性和形態(tài)發(fā)生。其刺激有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動性和基質(zhì)侵襲的能力使其在的血管生成、腫瘤發(fā)生和組織再生等過程中發(fā)揮重要作用[36]。與PEDF和HGF不同，IL-6更像是一柄雙刃劍，既是促炎性細(xì)胞因子（pro-in flammatory cytokine），又是抗炎性肌細(xì)胞因子(anti-in flammatory myokine)[37]。但由于后者主要見于運(yùn)動中由肌細(xì)胞分泌，在本研究中的變性組織中更合理地理解應(yīng)該是其促炎作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中所見，這些研究提示：MAPC培養(yǎng)條件可能會增加hADSCs的免疫抑制活性、抑制炎癥反應(yīng)、并為神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)和保護(hù)作用，因此，移植后，應(yīng)該能在受體組織中很好地存活并保護(hù)受體組織中的神經(jīng)細(xì)胞。

為在動物模型中證實(shí)MAPC培養(yǎng)條件能改善hADSCs的免疫抑制活性、抑制炎癥反應(yīng)以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的推測，筆者將這些細(xì)胞移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔并檢測其存活及對變性的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果證明假設(shè)是合理的：不論是形態(tài)學(xué)觀察還是視功能檢測指標(biāo)，均顯示移植的hADSCs不僅能在視網(wǎng)膜中很好存活，還具有很強(qiáng)的視網(wǎng)膜保護(hù)作用，不僅ONL厚度明顯增加、TUNEL陽性細(xì)胞顯著減少，而且能客觀反應(yīng)部分視覺功能的ERG檢查的b波波幅也明顯高于對照組。關(guān)于MAPC-hADSC移植治療的作用機(jī)理，筆者推測主要與MAPC-hADSC的旁分泌營養(yǎng)作用及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，至少在初步實(shí)驗(yàn)中未見到明顯的MAPC-hADSC轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行替代治療的證據(jù)。

本研究結(jié)果提示，在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病等疾病的細(xì)胞治療中，MAPC培養(yǎng)條件下的ADSCs有明顯的體外制備和干預(yù)能力的優(yōu)勢，可能會有廣闊的應(yīng)用前景。進(jìn)一步推論，本研究的結(jié)果對通過不同培養(yǎng)條件遴選合適的供體細(xì)胞以應(yīng)對不同的臨床疾病具有一定的指導(dǎo)意義。

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