胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和體外增殖能力的測(cè)定

袁松濤 薛志剛 林卿 劉慶淮 范國平

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）是引起50歲以上人群不可逆致盲眼病的首位病因[1]，全球大約有3～5千萬患者。根據(jù)脈絡(luò)膜新生血管形成或黃斑區(qū)萎縮，AMD可分為干性和濕性兩種類型。目前對(duì)于濕性AMD臨床利用Avastin、Lucentis以及光動(dòng)力治療可以有效控制疾病的進(jìn)展，但是在白人中濕性AMD患者僅僅占患者的10﹪～15﹪，而干性AMD患者占到85﹪～90﹪。中國人AMD的研究初步顯示中國人中干性AMD患者比例也很高[2-3]。目前臨床上沒有任何有效的治療方法可以控制干性AMD的發(fā)生發(fā)展。鑒于干性AMD病理學(xué)上表現(xiàn)為黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）的變性和退化(degeneration)，因此RPE細(xì)胞移植始終被認(rèn)為是治療的研究方向，移植的RPE細(xì)胞可以替代退化的細(xì)胞，相關(guān)的研究也證實(shí)RPE細(xì)胞移植可以保持或恢復(fù)患者的視力[4]。目前有多種細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)研究，包括人類胚胎干細(xì)胞（hESCs）或誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（hiPSCs）分化而成的RPE細(xì)胞、自體RPE轉(zhuǎn)位移植、自體虹膜色素上皮細(xì)胞（iris pigment epithelium,IPE），以及胎兒來源RPE（fetal RPE,fRPE）。多功能干細(xì)胞來源的RPE在移植中展現(xiàn)出了非凡的前景，但是還存在潛在的形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)和低分化率；患者自體RPE轉(zhuǎn)位移植手術(shù)復(fù)雜，存在PVR嚴(yán)重并發(fā)癥，AMD復(fù)發(fā)的問題；IPE對(duì)某些視網(wǎng)膜變性模型具有治療作用[5]，但是對(duì)IPE和RPE的表達(dá)譜研究表明IPE缺乏視紫紅質(zhì)循環(huán)中的某些關(guān)鍵酶，并不能完全替代RPE的生理功能[6]。fRPE的移植研究也很早就有開展，具有免疫原性低、易于同宿主視網(wǎng)膜整合、完全的RPE功能等特點(diǎn)。在這里筆者描述了fRPE的原代培養(yǎng)，鑒定，以及促體外增殖的研究。本研究希望為AMD的治療提供豐富的胎兒RPE細(xì)胞來源。

材料及方法

一、fRPE細(xì)胞原代培養(yǎng)

本研究的所有工作均符合赫爾辛基宣言，并通過了倫理委員會(huì)評(píng)審。胎兒RPE細(xì)胞的培養(yǎng)基使用阿爾法基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification，Sigma-Aldrich?）為基液并配以10﹪熱滅活的胎牛血清(heated inactivated FBS，Thermo Scientific No:SH30071.03IH)，2mmol/L L-谷 氨酸(L-glutamine，Gibco?),1X非必需氨基酸（1X Non essential amino acid，Gibco?），1﹪ N1補(bǔ)充劑（N1 supplements，Sigma-Aldrich?），0.25 mg/ml?；撬幔═aurine，Sigma-Aldrich?），0.013 μg/L 三碘甲狀腺氨酸（Triiodo-thyronine，Sigma-Aldrich?），以 及1:100青霉素/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin,Gibco?)和20 μg/L 氫羥腎上腺皮質(zhì)素（Hydrocortisone，Sigma-Aldrich?）。

原代fRPE來源于流產(chǎn)胎兒眼睛，將胎兒眼睛用抗生素浸泡后，移入PBS溶液，剪除角膜，去除虹膜和晶狀體，輕輕擠出神經(jīng)視網(wǎng)膜，可以看到眼球壁內(nèi)側(cè)的一層黑色組織就是RPE。在解剖顯微鏡下，用鑷子小心撕下這一層色素膜，使其與脈絡(luò)膜分離開，剩余的半透明脈絡(luò)膜組織中有粗大的血管，揭下的RPE呈現(xiàn)小片狀單層細(xì)胞。將分離的RPE用0.25﹪胰蛋白酶（Gibco?）溶液消化處理后解離成單細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。將RPE懸液種植于附有基質(zhì)膠的6孔培養(yǎng)板中。

二、fRPE傳代

fRPE的培養(yǎng)液每2 d需更換1次，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)可以傳代。將fRPE細(xì)胞培養(yǎng)基抽離后，用PBS溶液清洗細(xì)胞。將細(xì)胞浸于0.25﹪的胰蛋白酶溶液中處理15min。待細(xì)胞與組織板分離后加入培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用微量移液管反復(fù)吹打細(xì)胞結(jié)塊直至細(xì)胞結(jié)塊消失。179×g離心5min后，用培液重懸細(xì)胞。根據(jù)不同組織板的培養(yǎng)面積，將適量的細(xì)胞懸液接種于附有基質(zhì)膠的培養(yǎng)板中。

三、免疫熒光染色對(duì)fRPE的鑒定

將RPE細(xì)胞分離后接種于鋪有基質(zhì)膠的蓋玻片上。用1×PBS清洗后，將RPE細(xì)胞用4﹪多聚甲醛固定20～30min后，用1×PBS漂洗3次。用0.4﹪的Triton X-100對(duì)細(xì)胞通透化處理20min，用1×PBS漂洗3次。1﹪的牛血清白蛋白（BSA）封閉1h后加入一抗。本實(shí)驗(yàn)中將用到anti-ZO1以及anti-RPE65作為鑒定RPE特性的抗體。溫室孵育1h后，用1×PBS漂洗3次并加入二抗避光孵育1h。用1×PBS漂洗3次后加入H33342染核5min。用PBS漂洗多余染核染料后用5μl封片劑封片。

四、二芳基脲衍生物WS3對(duì)fRPE增殖的影響

以二甲基亞砜（DMSO）溶解WS3(Xcess Biosciences,Inc)，WS3的工作濃度為25 nmol/L。將P2代fRPE細(xì)胞分3組，別培養(yǎng)在fPRE培養(yǎng)液，fRPE培養(yǎng)液添加WS3,以及加入等體積DMSO的fRPE培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每天更換以保證RPE細(xì)胞獲得持續(xù)的WS3及DMSO的接觸。持續(xù)5 d用上文所述胰蛋白酶處理方式收集細(xì)胞，用培液重懸細(xì)胞后，將10μl細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)fRPE細(xì)胞增殖率采用單因素方差分析，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

不同胎兒來源的fRPE細(xì)胞并未在原代培養(yǎng)中展現(xiàn)出不同。剛接種貼壁后第1天的fPRE可以看到明顯的色素，但是色素已經(jīng)開始脫失（圖1a）。fRPE生長迅速，表現(xiàn)出極強(qiáng)的體外增殖能力，第3天細(xì)胞就生長到很高的密度，細(xì)胞中色素已經(jīng)大部分消失，細(xì)胞呈現(xiàn)梭型（圖1b）。第10天細(xì)胞生長至碰壁狀態(tài)，進(jìn)入靜止期，細(xì)胞密度不再增加。此時(shí)所有細(xì)胞展現(xiàn)出了RPE細(xì)胞鋪路石樣的典型形態(tài)，仍有部分細(xì)胞存在色素（圖1c）。如果不傳代而繼續(xù)培養(yǎng)，3周后fRPE開始合成色素顆粒，細(xì)胞內(nèi)色素開始顯著增加（圖1d）。傳代后fRPE細(xì)胞則再次失去典型形態(tài)，色素完全脫失，直至細(xì)胞生長融合后3周后又再次開始合成色素。一般的fRPE可持續(xù)傳至4代左右，第3代開始的RPE較前2代生長速度明顯減緩（表1），有些細(xì)胞會(huì)展現(xiàn)出衰老的形態(tài)。

表1 初始細(xì)胞數(shù)及傳代之后10d 細(xì)胞數(shù)

二、WS3對(duì)fRPE細(xì)胞體外增殖的影響

有研究表明作為小分子化合物WS3[7]可以促進(jìn)fRPE的體外增殖。本實(shí)驗(yàn)探討了WS3對(duì)fRPE體外增殖的影響，三組fRPE各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果見表2。因三組細(xì)胞的初始接種數(shù)量不一致，因此用細(xì)胞增殖率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：培養(yǎng)液中加入DMSO和WS3對(duì)fRPE增殖率的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05,n=3），各組細(xì)胞的生長曲線見（圖2）。從傳代后第4天開始，接觸WS3的fRPE表現(xiàn)輕度增強(qiáng)的生長趨勢(shì)，但是并未表現(xiàn)出與文獻(xiàn)報(bào)道中那樣明顯的促增殖作用[7]。

圖1 倒置顯微鏡明場(chǎng)下的fRPE細(xì)胞（×100）

三、體外培養(yǎng)的fRPE分子標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)

體外培養(yǎng)的fRPE通過抗體免疫熒光染色，可以檢測(cè)到各種RPE特異表達(dá)的分子標(biāo)志物：ZO-1、RPE65 等（圖 3）。

討 論

fRPE的臨床研究也早有報(bào)道［8-9］，但是始終沒有得到臨床眼科的廣泛接受，除了當(dāng)初研究的設(shè)備、技術(shù)條件的限制外，其中一個(gè)重要的原因就是倫理問題。胎兒組織臨床應(yīng)用始終是敏感的倫理問題，包括胚胎干細(xì)胞同樣如此。本研究顯示，fRPE具有極其巨大的體外增殖能力，一只胎兒眼的RPE細(xì)胞在P0代體外就能擴(kuò)增得到1千萬個(gè)RPE細(xì)胞。如果按照胚胎干細(xì)胞來源RPE臨床實(shí)驗(yàn)的報(bào)道［10］，每個(gè)干性AMD患者需要移植5萬個(gè)細(xì)胞來計(jì)算，一個(gè)胎兒眼的RPE細(xì)胞能夠提供數(shù)百名AMD患者接受RPE細(xì)胞移植治療。能夠極大的減輕對(duì)fRPE臨床應(yīng)用的倫理爭論，同時(shí)也徹底解決移植手術(shù)供體缺乏的問題，而且在安全性上也明顯優(yōu)于干細(xì)胞來源的RPE細(xì)胞。在fRPE培養(yǎng)的過程中也只是使用了一般的培養(yǎng)試劑，并沒有特別昂貴的細(xì)胞因子，這樣避免了患者接受移植手術(shù)需要支付高昂的治療費(fèi)，這些都為fRPE的臨床應(yīng)用提供了非常有利的條件。

fRPE原代培養(yǎng)中撕下RPE細(xì)胞片層是關(guān)鍵，需要精細(xì)的顯微操作。這一操作可以獲得足夠量的細(xì)胞，同時(shí)保證細(xì)胞的純度，避免其他細(xì)胞的污染。fRPE細(xì)胞原代培養(yǎng)還需要注意組織的新鮮，胎兒眼一旦離體時(shí)間過長，組織開始溶解，則不能獲得比較完整的RPE組織片層，只能零散地刮下散在的黑色素顆粒，既容易混雜有其他細(xì)胞，獲取的細(xì)胞也不易貼壁。

圖3 熒光共聚焦顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的fRPE分子標(biāo)志物形態(tài)（抗體免疫熒光染色×600））

文獻(xiàn)報(bào)道了WS3可以促進(jìn)RPE細(xì)胞的體外增殖[7]，筆者觀察到的促增殖作用并沒有文獻(xiàn)報(bào)道的具有明顯促增殖作用，僅僅在融合后有輕微的促進(jìn)細(xì)胞生長的趨勢(shì)，對(duì)傳代的代數(shù)影響也同樣不甚明顯?？赡艿脑蚴翘簜€(gè)體間的差異、細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)不盡相同。此外，WS3添加的fRPE在指數(shù)生長期階段在形態(tài)上更接近于纖維細(xì)胞，和常規(guī)培養(yǎng)的RPE細(xì)胞有明顯區(qū)別。WS3的促增殖作用對(duì)fRPE的生理功能是否有影響，是否適合用于Ex Vivo治療的體外培養(yǎng)，還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證明。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了fRPE巨大的體外增殖能力，在其原代體外培養(yǎng)過程中可以表達(dá)多種RPE特有的功能性標(biāo)志物，為需要RPE移植的AMD患者提供了一種豐富的細(xì)胞來源。

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