低氮脅迫對谷子苗期光合指標及生理性能的影響

王宇珅，張 敏，孟曉偉，韓淵懷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801；2.黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

氮是作物生長的必需元素之一，對維持作物新陳代謝、生長發(fā)育、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。缺氮時作物表現(xiàn)出生長發(fā)育受阻，植株個體矮小，葉色發(fā)黃的典型表型，影響產(chǎn)量的形成。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施加氮肥往往成為確保作物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)的主要栽培手段。然而，過量施加氮肥不僅造成氮肥利用效率低下，而且還給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的壓力，造成一系列生態(tài)失衡問題。據(jù)統(tǒng)計，我國氮肥利用效率約為35%，低于世界40%～60%的水平[1]。如何提高氮肥利用效率，特別是提高作物在缺氮環(huán)境下的氮利用效率成為亟待解決的關(guān)鍵問題。研究表明，在氮缺乏時，水稻和小麥可通過促進其根系伸長來獲得深層土壤的氮素；在玉米的研究中也發(fā)現(xiàn)，具有較長根系的品種，具有更高的氮利用效率[2-5]。時麗冉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低氮耐受的谷子品種在缺氮時苗高和生物量降低幅度較小、氮利用效率較高、根長增長幅度較大。在苦蕎的研究中也發(fā)現(xiàn)，缺氮抑制其地上部生長，而促進根系伸長生長，導(dǎo)致根冠比增加[7]。

缺氮也會影響植物體內(nèi)氮還原同化酶活性。謝孟林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氮缺乏時玉米苗期根系硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）活性均顯著下降。劉鵬等[9]研究表明，耐低氮型高粱品種葉片可保持相對較高的NR 活性。張楚等[7]研究表明，低氮脅迫下苦蕎苗期NR 活性、蛋白質(zhì)含量顯著下降。呂雪梅[10]研究發(fā)現(xiàn)，NO3--N 缺乏時，小麥根系NR 和GS 活性明顯提高；而NH4+-N缺乏時，根系GS 和谷氨酸合成酶（GOGAT）活性顯著提高。此外，氮匱乏也會影響植物體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活性。缺氮時，苦蕎根系SOD、POD 活性以及根系MDA、可溶性糖及游離脯氨酸含量顯著升高。李強等[11]研究發(fā)現(xiàn)，氮供應(yīng)不足時，玉米具有較高的POD 活性以維持其正常的生命活動。王俊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對低氮耐受的煙草品種在低氮環(huán)境下具有較高的SOD 活性，且積累較少的MDA。

植物中70%的氮存在于葉綠體中，因此，氮素是否充足直接影響著植物葉片葉綠素含量、光合速率以及熒光特性[13]。有研究表明，氮供應(yīng)不足時谷子葉片中葉綠素含量顯著降低[14]。WU 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺氮時，玉米氣孔導(dǎo)度（Gs）和光飽和點（Ls）降低，且隨著缺氮程度加劇，玉米葉綠素含量顯著降低。ZHU 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理下柳枝稷的葉片凈光合速率和總?cè)~綠素含量顯著降低。ZHAO 等[17]研究表明，缺氮顯著降低了高粱葉片葉綠素含量和凈光合速率，導(dǎo)致生物量產(chǎn)量降低。于雪等[18]研究表明，缺氮顯著降低了甜菜葉片暗適應(yīng)下PSⅡ光化學最大效率（Fv/Fm）和光化學淬滅（qP），增加了非光化學淬滅（qN），進而抑制PSⅡ光化學活性，降低了光合作用。時麗冉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著供氮水平的降低，小黑麥葉片的初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm）逐步升高，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）以及PI abs 均表現(xiàn)為下降趨勢。何海鋒等[20]研究表明，施中氮提高了柳枝稷的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度、細胞間隙CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等光合指標，進而提高干物質(zhì)積累。以上結(jié)果表明，可通過評價低氮處理下谷子形態(tài)、氮同化相關(guān)酶、抗氧化相關(guān)酶活性及光合性能指標來評價作物的耐低氮能力。

谷子（Setaria italica），是禾本科自花授粉作物，也是我國北方重要的雜糧作物。由于其具有較強的抗逆性，耐旱耐貧瘠，且基因組較小，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為新的模式作物。目前針對氮虧缺條件下，谷子苗期形態(tài)、氮同化關(guān)鍵酶、抗氧化酶活性及光合性能相關(guān)研究的報道還較少，不利于對苗期谷子耐低氮特性的深入研究。

本研究在水培條件下，分析谷子在低氮脅迫下谷子表型性狀、生理生化指標及光合性能指標的變化，旨在為谷子耐低氮營養(yǎng)脅迫研究奠定基礎(chǔ)，為培育耐逆作物品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為EMS 誘變晉谷21 獲得的超早熟突變體Xiaomi，經(jīng)多年種植鑒定，性狀可穩(wěn)定遺傳。該材料由山西農(nóng)業(yè)大學雜糧分子育種團隊提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在人工氣候室內(nèi)進行。選取籽粒大小飽滿、均勻一致、無病蟲害的種子1 000 粒，用10%次氯酸鈉和75%酒精依次消毒后，無菌水沖洗5～7 次，置于育苗棉上，蒸餾水澆灌，確保種子萌發(fā)。待幼苗長至兩葉一心期時，改用Hoagland 全營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3 d 更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)期間每天對材料進行通氣處理1 h。培養(yǎng)條件為光期16 h，溫度28 ℃；暗期8 h，溫度22 ℃。待幼苗長至五葉一心期時，開始對材料進行低氮脅迫（LN，硝酸鉀為氮源），正常氮處理（NN）為對照。其中，正常氮濃度為2 mmol/L，低氮脅迫濃度為0.2 mmol/L。

1.3 測定指標及方法

低氮脅迫7、15 d 時，分別選擇長勢一致的正常氮處理及低氮處理的谷子幼苗各10 株，分別對其株高、旗葉長、旗葉寬、葉厚、莖粗、根長、根冠比等進行測定。

低氮脅迫15 d 時，采用凱氏定氮法測定谷子葉片及根系的全氮含量。

低氮脅迫2 h、72 h、15 d 時，測定谷子葉片葉綠素含量。

低氮脅迫7 d 時，采用便攜式光合儀（CIRAS-3，美國PP SYSTEMS）測定凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及水分利用效率（3 個生物學重復(fù)）。

低氮脅迫15 d 時，采用便攜式植物效率分析儀（Handy PEA，英國Hansatech），測定葉綠素熒光動力參數(shù)（5 個生物學重復(fù)）。

硝酸還原酶（NR）活性采用改良版離體法進行測定[21-22]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法進行測定[21-22]；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定[21-22]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑法測定[21-22]；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Excel 2019 和SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對谷子苗期表型性狀的影響

由圖1 可知，低氮脅迫7 d 時，谷子根系與對照（正常氮）相比顯著增長；而脅迫15 d 后，與對照相比，低氮處理后谷子株高顯著降低，表現(xiàn)為老葉發(fā)黃、嫩葉葉片早衰葉色較淺、葉表面積減少，而根系顯著增長、根表面積增加、側(cè)根數(shù)量增加（圖1）。

進一步對低氮脅迫下谷子苗期的農(nóng)藝性狀進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），與對照（正常氮）相比，低氮處理下谷子的根長和總根長顯著增長，其中，根長顯著增加了45.18%（7 d，P＜0.05）和50.20%（15 d，P＜0.01），總根長在低氮脅迫15 d 時極顯著增加了27.73%（P＜0.01），表明缺氮時，谷子通過增加根系長度來增加其對氮素的吸收面積。與對照相比，低氮脅迫15 d 時，谷子的根冠比極顯著增加12.17%（P＜0.01），表明低氮環(huán)境可誘導(dǎo)谷子根系發(fā)育，使根冠比增加進而響應(yīng)外界低氮脅迫。

表1 不同氮處理對谷子苗期農(nóng)藝性狀的影響

低氮處理7 d 時，谷子地上部生長顯著受到抑制，其中，株高、旗葉寬、莖粗分別較對照顯著降低了5.81%、5.69%、11.30%；而在低氮處理15 d 時，谷子的株高、旗葉長、旗葉寬、莖粗、葉厚和葉片總氮含量與對照之間差異更加顯著，較對照分別降低了18.01%、16.14%、12.73%、15.79%、16.67%、25.88%。以上結(jié)果表明，低氮會抑制谷子地上部分生長，而促進其根系伸長，增加根表面積。

2.2 低氮脅迫對谷子苗期光合性能的影響

由圖2 可知，低氮處理下谷子的總?cè)~綠素含量極顯著下降，且在脅迫2 h、72 h、15 d 時，與對照（正常氮）相比分別降低了28.10%、28.07%、19.84%（P＜0.01）。表明缺氮造成葉綠素合成受阻，從而影響植物的光合作用。分析低氮脅迫下谷子葉片的凈光合速率及光響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)低氮處理7 d 時，葉片凈光合速率較對照表現(xiàn)為下降的趨勢，且在不同光照強度下低氮處理的凈光合速率均低于對照，表明缺氮會降低谷子的光合效率（圖2）。同時，低氮脅迫下谷子葉片氣孔導(dǎo)度下降，而胞間CO2濃度高于正常氮處理，表明低氮脅迫可能影響了光合作用的碳同化效率（圖2）。

進一步分析低氮脅迫15 d 后谷子葉片葉綠素熒光參數(shù)，結(jié)果表明（表2），PI abs、φEo、φRo、ETo/CSm 極顯著降低（P＜0.01）。葉片F(xiàn)v/Fm 在低氮環(huán)境下變化較小，且隨著光強增加并未發(fā)現(xiàn)與對照之間存在顯著差異，表明葉片光系統(tǒng)不存在光抑制現(xiàn)象，因此，缺氮可能是通過抑制光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞效率，進而影響其光合效率。

表2 低氮脅迫對谷子苗期葉片熒光參數(shù)的影響

2.3 低氮脅迫對谷子苗期膜完整性的影響

丙二醛（MDA）含量是常用的膜脂過氧化指標，MDA 含量越高，其膜脂過氧化程度就越嚴重，膜的透性越大。由圖3 可知，與對照（正常氮）相比，低氮脅迫導(dǎo)致葉片MDA 含量增加，而根系MDA 含量表現(xiàn)為減少的趨勢。其中，谷子葉片MDA 含量在處理2 h 時顯著增加了31.42%（P＜0.05），表明缺氮時，谷子細胞膜穩(wěn)定性受到破壞，影響細胞的結(jié)構(gòu)完整性。而根系的MDA 含量降低，且在處理2 h 時較對照（正常氮）顯著下降了44.94%（P＜0.05），表明低氮脅迫下，谷子根系細胞膜穩(wěn)定性較好，有利于維持根系對氮素的吸收。

2.4 低氮脅迫對谷子苗期硝酸還原酶活性的影響

由圖4 可知，低氮處理72 h 和15 d 時，谷子葉片硝酸還原酶（NR）活性顯著降低，且分別降低了48.92%（P＜0.01）和46.88%（P＜0.05），硝酸還原酶為誘導(dǎo)性酶，受硝態(tài)氮的誘導(dǎo)，較低的葉片硝酸還原酶活性表明低氮脅迫下谷子根系吸收的硝態(tài)氮分配到葉片的量較少，進而抑制了NR 活性。低氮脅迫2 h 時，谷子根系NR 活性極顯著增加了75.83%（P＜0.01）；而在低氮脅迫72 h 和15 d 時，相較于正常氮處理，低氮處理下的谷子根系NR 活性沒有明顯變化，表明在短期脅迫（2 h）時，谷子會通過提高NR 活性，促進根系對硝態(tài)氮的還原，增加氮吸收水平，從而響應(yīng)短期低氮脅迫；而在長期脅迫時，由于NR 為硝態(tài)氮的誘導(dǎo)性酶，缺氮使得NR 活性誘導(dǎo)水平降低。

2.5 低氮脅迫對谷子苗期抗氧化酶活性的影響

從圖5 可以看出，低氮處理下，谷子葉片過氧化物酶（POD）活性較對照（正常氮）表現(xiàn)為增加的趨勢，根系POD 活性則表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。與對照相比，低氮脅迫2 h 時谷子葉片POD 活性顯著增加了45.01%（P＜0.05）；而在低氮脅迫72 h和15 d 時，葉片POD 活性與對照相比無顯著差異。谷子根系POD 活性在低氮處理2、72 h 時分別較正常氮處理顯著增加了20.97%（P＜0.05）和41.85%（P＜0.05）；而在低氮脅迫15 d 時與對照間差異不顯著。表明在相對較短期的低氮脅迫下（2、72 h），谷子葉片和根系POD 活性增強，加強其對超氧陰離子等的代謝來適應(yīng)低氮脅迫。

從圖5 可以看出，低氮脅迫2、72 h 時，谷子葉片CAT 活性與對照之間差異不顯著，而低氮脅迫15 d 時，谷子葉片CAT 活性較對照顯著降低了27.29%（P＜0.05）。谷子根系CAT 活性則表現(xiàn)為在低氮脅迫2 h 時較對照顯著增加了99.61%（P＜0.05）；而在脅迫72 h 和15 d 時，根系CAT 活性與對照之間無顯著差異。

由圖5 可知，低氮脅迫2 h 時，葉片SOD 活性較對照（正常氮）顯著增加了18.07%（P＜0.05）；而在低氮脅迫72 h 和15 d 時，葉片SOD 活性與正常氮處理相比有所降低，但差異不顯著。與正常氮處理相比，谷子根系SOD 活性在低氮處理15 d 時顯著降低，降幅為26.51%（P＜0.05）；而在低氮脅迫2、72 h 時，根系的SOD 活性有所增加，但與對照間差異不顯著。結(jié)果表明，低氮脅迫下，谷子葉片和根系SOD 活性均受氮脅迫顯著影響，且在葉片中SOD主要通過在短期脅迫中發(fā)揮作用，而在根系中SOD主要參與低氮脅迫的長期響應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

氮對作物維持正常生長發(fā)育，作物的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)發(fā)揮著重要的作用[23]。張立媛等[24]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下谷子株高顯著降低，且赤谷6 號、赤谷8 號和赤谷9 號根長顯著增長。連盈等[25]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下谷子苗期形態(tài)上主要表現(xiàn)為葉片數(shù)減少、葉長葉寬減小、葉面積變小。程麗麗等[26]研究發(fā)現(xiàn)，低氮條件下光皮樺的株高顯著降低，且老葉葉色發(fā)黃、葉片較小，表現(xiàn)為典型的缺氮表型，同時根冠比、總根長、根系總表面積和根系平均直徑均有所增加，但其地上氮含量、地下氮含量和氮累積量均呈下降趨勢。陳凌等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同糜子品種的株高、葉面積在低氮條件下均顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理后谷子株高、莖粗顯著降低，葉色較淺，葉面積減小，表明低氮脅迫顯著影響了谷子葉片的生長發(fā)育；根系顯著增長，根總長、根表面積及根體積增加，側(cè)根數(shù)量增加，且隨著脅迫時間的增加，地上部分及地下部分表型差異更加顯著，這與前人研究結(jié)果一致，表明低氮脅迫會抑制谷子地上部分生長，優(yōu)先供應(yīng)地下部分發(fā)育以增加土壤中根系表面積和體積，進而響應(yīng)低氮脅迫。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理15 d 后谷子葉片和根系的總氮含量降低，且葉片中的總氮含量顯著下降，該結(jié)果與前人結(jié)果一致，表明低氮脅迫會影響谷子表型及氮含量。

氮素供應(yīng)不足，植物葉片的光合性能和葉綠素熒光動力參數(shù)都受到很大的影響。植物葉片中的氮素絕大多數(shù)存在于葉綠體中，參與了一系列光合進程[28]。有研究表明，在低氮環(huán)境下，甜菜第1 對真葉局部逐漸變黃，第2 對真葉生長受阻并且出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，功能葉葉綠素含量持續(xù)降低[29]。低氮脅迫后，谷子葉綠素含量和光合速率呈下降趨勢，表明氮脅迫會降低葉綠素含量、影響葉片發(fā)育，進而使植株光合作用降低[30]。苗期低氮脅迫下，玉米葉綠素含量、Fv、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Fv'/Fm' 和qP 等葉綠素熒光特性也均顯著降低，且Pn、Gs 和Tr 呈下降趨勢，Ci 則顯著上升[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理下谷子葉綠素含量明顯下降，這與劉大麗等[29]、李明哲等[30]研究結(jié)果一致。低氮處理7 d 時，谷子的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均呈下降趨勢，而胞間CO2濃度呈上升趨勢；低氮脅迫15 d 時谷子葉片PI abs、ETo/CSm、φEo 明顯降低，表明缺氮抑制了光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞效率。以上結(jié)果與前人研究一致，表明低氮脅迫下谷子葉片沒有發(fā)生光抑制，對光能的吸收和捕獲影響不顯著，但顯著降低電子傳遞的能力以及葉片活性。

植物吸收土壤中的銨態(tài)氮或硝態(tài)氮，需經(jīng)過還原同化作用才能合成氨基酸或蛋白質(zhì)。氮供應(yīng)不足，植物氨基酸或蛋白質(zhì)合成受阻，氮代謝途徑發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氮時玉米根系NR 活性降低，且NR 活性隨氮素營養(yǎng)水平的提高而增強[8]。劉鵬等[9]研究表明，低氮處理后高粱的葉片NR 活性均有不同程度降低，且生育后期高粱葉片NR 活性降低，但是耐低氮型高粱葉片仍保持著相對高的NR 活性。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理下，谷子葉片和根系中NR 活性均顯著降低，且葉片中的NR 活性顯著高于根系中NR 活性。低氮脅迫2 h 時，谷子根系中NR 活性顯著高于對照（正常氮），而在低氮脅迫72 h 和15 d 時根系NR 活性較低氮脅迫2 h 時顯著降低，這與前人研究結(jié)果不同，因此，推測短期低氮脅迫時，谷子根系NR 活性增強進而促進根系對硝態(tài)氮的還原，增加氮吸收水平。

氮脅迫會造成植物體內(nèi)活性氧及超氧陰離子的大量積累，對植物膜結(jié)構(gòu)造成破壞。POD、SOD 和CAT 是植物抗氧化主要酶，其活性水平能直接反映植物受外界逆境影響的程度，MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)物，逆境脅迫下MDA 含量越高，其膜脂過氧化程度就越嚴重。程麗麗等[26]研究表明，低氮處理下3 個基因型光皮樺幼苗POD、SOD 活性均顯著降低。張楚等[7]研究發(fā)現(xiàn)，缺氮時不同苦蕎品種MDA 含量均顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理后，谷子葉片及根系（脅迫2 h）的POD 活性表現(xiàn)為增加趨勢，說明低氮脅迫下谷子可能通過增強葉片和根系POD 活性來維持細胞內(nèi)活性氧的代謝平衡，從而降低膜脂受損程度，減緩葉片和根系衰老。低氮脅迫2 h 時，谷子葉片SOD 活性最強，之后開始下降；根系SOD 活性在低氮脅迫15 d 時顯著降低，但在低氮脅迫2、72 h 時較正常氮相比呈上升趨勢，表明短期低氮脅迫下，谷子可通過提高SOD 活性來維持植物自由基代謝平衡。谷子葉片CAT 活性在低氮脅迫2 h 時呈增加趨勢，在脅迫72 h 和15 d 時呈明顯下降趨勢，而根系CAT 活性呈顯著上升趨勢。與對照相比，低氮脅迫下谷子葉片MDA 含量呈增加趨勢；而根系MDA 含量較對照有下降的趨勢，這與前人研究結(jié)果不同，推測可能是由于試驗條件差異造成的結(jié)果。

綜上所述，氮缺乏時，谷子通過促進根系發(fā)育、減小葉表面積以及降低株高等表型變化來響應(yīng)逆境脅迫；同時通過調(diào)整葉片及根系NR、POD、SOD、CAT 活性及MDA 含量來調(diào)節(jié)體內(nèi)氮代謝途徑，響應(yīng)低氮脅迫。