新芩梅顆粒的制備及藥效學(xué)研究

尤本明，馬 天，潘勇華，李 斌，劉繼勇＊

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，上海200437）

［本文編輯］蘭 芬

芩梅顆粒是第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院用于治療銀屑病的特色自制制劑，由黃芩、青黛、當(dāng)歸、黃芪、烏梅5味中藥材組成，具有清熱解毒、益氣活血的功效，臨床主要用于治療尋常型和膿皰型銀屑病，療效確切，安全性好，且價格低廉，服用方便，深受病人歡迎。但該制劑存在服用劑量大（20g／次，tid）、含糖量高、不適用于糖尿病病人等缺點。本研究在保持劑型不變的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了芩梅顆粒的提取和制劑工藝，將提取物稠膏減壓干燥得到干浸膏，采用一步制粒工藝制粒，減少糊精和糖粉等輔料的用量，降低了顆粒的口服劑量和含糖量，制備得到新芩梅顆粒，并對其藥效學(xué)進(jìn)行考察。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 流化床包衣制粒機(jī)（深圳信誼特科技有限公司）；倒置電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；JH－2102型電子天平（上海精密儀器有限公司）；FA－2004萬分之一電子天平（上海天平儀器廠）；DL－180A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；FSH－2高速勻漿機(jī)（武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司）；5804R臺式高速大容量離心機(jī)（德國艾本德公司）。

1.2 藥品和試劑 黃芩（批號LY2012040237，上海雷允上中藥飲片廠）；青黛（批號XD11072101）、烏梅（批號DH2012020201，上海信德中藥公司飲片廠）；當(dāng)歸（批號DH2012032702，上海德華國藥制品有限公司）；黃芪（批號YT2012050211，上海余天成中藥飲片有限公司）；己烯雌酚注射液（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；秋水仙堿、白凡士林（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；消銀顆粒（陜西康惠制藥股份有限公司）；咪喹莫特乳膏（揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；硝酸還原酶法一氧化氮（NO）測定試劑盒、硫代巴比妥酸法丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物醫(yī)學(xué)研究所）；乙醇（常州楊園化工有限公司）；蛋白糖（鄭州鴻祥化工產(chǎn)品有限公司）；羥丙甲纖維素（杭州崇科化工有限公司）。

1.3 動物 C57小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～20g；昆明種小鼠，SPF級，雌性，體重20～22g；Balb／c小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～20g［上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007－0005］。

2 方法和結(jié)果

2.1 處方藥材的提取 稱取黃芩、當(dāng)歸、黃芪、烏梅藥材各3kg，青黛藥材1.5kg，置多功能提取罐中，加入8倍量的水煎煮1.5h，煎煮兩次，濾過后合并提取液，減壓濃縮至稠膏相對密度為1.18（60℃測定）［1］。加入適量95%乙醇，調(diào)節(jié)溶液乙醇濃度至70%，4℃靜置24h。過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后，醇沉液置蒸發(fā)鍋中濃縮成流浸膏，然后將流浸膏置60℃烘箱中干燥得干浸膏。干浸膏粉碎后過100目篩備用。

2.2 新芩梅顆粒的制備 采用一步制粒工藝制備新芩梅顆粒。取1kg干浸膏粉加入100g蛋白糖作為矯味劑，將細(xì)粉置于一步制粒機(jī)底部，設(shè)定風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速為1700r／min，進(jìn)風(fēng)溫度70℃，物料溫度38℃，以5%羥丙甲纖維素（HPMC，E5）作為黏合劑，霧化器壓力0.1MPa，噴入流化室制粒。制粒過程中設(shè)定黏合劑蠕動泵的梯度進(jìn)料速度為4→6→8r／min。制粒結(jié)束后關(guān)閉霧化器，繼續(xù)通入50℃熱風(fēng)干燥1h，將制得的顆粒過20～60目篩收集合格顆粒，計算成品率。成品率＝（合格顆粒重量／全部顆粒重量）×100%。計算得到顆粒成品率為72%。采用鋁塑復(fù)合膜進(jìn)行包裝，即得新芩梅顆粒成品，每袋4g，相當(dāng)于13.5g生藥。

2.3 對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層的形成影響 根據(jù)C57小鼠尾部鱗片表皮缺乏顆粒層的特性，模擬銀屑病角化不全的特征，考察新芩梅顆粒促進(jìn)表皮顆粒層生成的作用。取50只C57小鼠，雌雄各半，用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對照組，新芩梅顆粒低、中、高劑量組（0.1、0.2、0.4g·kg－1·d－1），陽性對照組（消銀顆粒0.175g·kg－1·d－1，用生理鹽水配制），灌胃給藥，0.2ml／次，bid?？瞻讓φ战M給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥14d，最后一次給藥后2h，將小鼠脫頸椎處死。取距尾根部2cm處背面皮膚一長條，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，在倒置顯微鏡下觀察鼠尾鱗片表皮顆粒層生成情況［2，3］。顆粒層細(xì)胞位于棘細(xì)胞層和透明層之間，呈梭形，胞漿內(nèi)有較多粗大的嗜堿性角質(zhì)透明顆粒。凡是一個鱗片有連接成行的顆粒層細(xì)胞，稱為有顆粒層的鱗片。計數(shù)連續(xù)100個鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)，結(jié)果見表1。觀察得知，空白對照組小鼠尾部鱗片缺乏或僅少量有顆粒層細(xì)胞，并且顆粒層細(xì)胞排列疏松；中、高劑量治療組和陽性對照組小鼠尾部鱗片顆粒層細(xì)胞排列緊密，有顆粒層的鱗片數(shù)目明顯增加，部分連接成行。低、中、高劑量治療組和陽性對照組均與空白對照組有顯著差異，表明新芩梅顆粒能夠促進(jìn)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層的形成，作用隨劑量的增大而增強(qiáng)，中、高劑量新芩梅顆粒的作用與消銀顆粒相當(dāng)。

表1 新芩梅顆粒對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響Table 1 The effect of Xinqinmei granules on formation of granular layer in mouse tail scale epidermis（n＝10，）

表1 新芩梅顆粒對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響Table 1 The effect of Xinqinmei granules on formation of granular layer in mouse tail scale epidermis（n＝10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與空白對照組比較

0 21.7±6.3低劑量治療組 0.1 38.6±8.1＊中劑量治療組 0.2 48.5±7.3＊＊高劑量治療組 0.4 52.8±9.3＊＊陽性對照組 0.175 51.7±8.9鱗片數(shù)空白對照組組別 劑量（g·kg－1·d－1） 有顆粒層的＊＊

2.4 對動情期小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響 60只雌性昆明種小鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，分別為空白對照組，模型對照組，低、中、高劑量治療組（新芩梅顆粒0.1、0.2、0.4g·kg－1·d－1），陽性對照組（消銀顆粒0.175g·kg－1·d－1）。除空白對照組以外的小鼠腹腔注射己烯雌酚注射液，0.2mg／次，qd，連續(xù)注射3d，誘導(dǎo)小鼠處于動情期。從第4天開始灌胃給藥，0.2ml／次，bid，連續(xù)給藥14d?？瞻讓φ战M和模型對照組小鼠給予等體積的生理鹽水。為了避免細(xì)胞有絲分裂受日夜節(jié)律的影響，最后一次給藥時間統(tǒng)一為上午8時。上午9時每只小鼠腹腔注射秋水仙堿2mg／kg，使有絲分裂停止于M期而便于計數(shù)［2，3］。下午2時脫頸處死全部小鼠，取陰道組織，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色。在倒置電子顯微鏡下逐一觀察每只小鼠的陰道上皮，計數(shù)300個基底細(xì)胞中發(fā)生有絲分裂的細(xì)胞數(shù)，以每100個基底細(xì)胞中發(fā)生有絲分裂的細(xì)胞數(shù)作為有絲分裂指數(shù)，結(jié)果見表2。觀察可見，有絲分裂細(xì)胞主要分布在基底層，高劑量治療組有絲分裂指數(shù)低，中劑量治療組和陽性對照組相當(dāng)，模型對照組的有絲分裂指數(shù)最高。表明新芩梅顆粒能夠抑制動情期小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

表2 新芩梅顆粒對小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和背部銀屑病樣皮損的影響Table 2 The effects of Xinqinmei granules on mitosis index of vaginal epithelia cells and psoriasiform skin injuries on the back of mice（n＝10，）

表2 新芩梅顆粒對小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和背部銀屑病樣皮損的影響Table 2 The effects of Xinqinmei granules on mitosis index of vaginal epithelia cells and psoriasiform skin injuries on the back of mice（n＝10，）

＊＊P＜0.01，與空白對照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與模型對照組比較

組別劑量（g·kg－1·d－1）有絲分裂指數(shù)一氧化氮（μmol·g－1）丙二醛（μmol·g－1）空白對照組 0 3.42±1.02 2.45±0.37＊＊低劑量治療組 0.1 2.44±0.81 0.82±0.16模型對照組 0 5.68±1.24＊＊0.79±0.29 2.75±0.83＊＊1.72±0.38△中劑量治療組 0.2 2.12±0.63△2.02±0.42 1.51±0.11△△高劑量治療組 0.4 1.94±0.46△△1.73±0.27△△1.46±0.20△△陽性對照組 0.1752.06±0.68△1.48±0.44△△1.42±0.35△△1.52±0.27△△

2.5 對小鼠背部銀屑病樣皮損的影響 取60只Balb／c小鼠，雌雄各半，分組情況同2.4項。將小鼠背部約2cm×1cm皮膚脫毛?？瞻讓φ战M在脫毛處涂抹白凡士林，其余各組小鼠均涂抹咪喹莫特乳膏造模，涂抹厚度1.0mm，qd，連續(xù)6d，給藥面積＞1cm×1cm，給藥后發(fā)生斑片狀脫毛反應(yīng)提示造模成功。次日開始灌胃給藥，0.2ml／次，bid，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥4周，每周觀察并記錄小鼠一般情況和局部皮損［4］。4周后手術(shù)切取各組小鼠背部皮膚，用預(yù)冷至4℃的生理鹽水沖洗，除去殘留的皮下組織和血管等雜質(zhì)，拭干。切取0.5g皮膚，放入盛有2ml預(yù)冷至4℃生理鹽水的小試管內(nèi)，用高速勻漿機(jī)1×104r／min勻漿兩次，每次10s，勻漿后 以68.48×g離心15min，取上清液－80℃冷藏。采用試劑盒測定其中NO和MDA的含量，結(jié)果見表2。小鼠造模成功后出現(xiàn)精神差、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少等癥狀，背部皮膚粗糙，毛發(fā)脫落明顯，有紅斑脫屑，部分可見出血點。給藥4周后，模型對照組皮損紅斑略有減輕；治療組和陽性對照組小鼠皮損癥狀明顯改善，紅斑鱗屑減輕，表明新芩梅顆?？梢愿纳沏y屑病的皮損紅斑癥狀，減少皮損部位炎癥因子NO和MDA的生成，與消銀顆粒效果相當(dāng)。

3 討 論

銀屑病是一種久治難愈且易反復(fù)發(fā)作的皮膚疾病，其臨床表現(xiàn)為全身紅斑和大量鱗屑，給病人生理和心理造成極大傷害，嚴(yán)重影響病人及家屬的生活質(zhì)量。目前對于銀屑病的治療多采用口服藥物、補(bǔ)骨脂素加紫外線照射光化學(xué)（psoralen ultraviolet A，PUVA）治療等綜合療法，但均存在較大問題?？诜幬锶缇SA酸類、糖皮質(zhì)激素類或抑制表皮細(xì)胞分裂的藥物，如甲氨蝶呤均具有較大的肝、腎毒性及其他副作用，停藥后極易復(fù)發(fā)。外用藥如芥子氣、煤焦油類、地蒽酚及卡泊三醇等均為強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物，對正常皮膚細(xì)胞具有極強(qiáng)的腐蝕作用，使用不當(dāng)極易對人體造成傷害。并且隨著對毒劑管理的加強(qiáng)，這類藥物的原料來源也越來越困難［5，6］。新的抗體類生物制劑，如依那西普、英利昔單抗等也開始應(yīng)用于某些重癥銀屑病的治療，但這類藥物的適應(yīng)證嚴(yán)格，對病人自身條件要求高，且生物制劑的長期不良反應(yīng)還有待進(jìn)一步明確，其價格昂貴，也限制了在臨床的廣泛應(yīng)用［7］。

銀屑病的組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生、炎癥細(xì)胞聚集和真皮乳頭部血管增生擴(kuò)張三大特征，從而導(dǎo)致角化過度、角化不全、顆粒層消失、棘細(xì)胞層增厚等癥狀。在研究中常利用小鼠尾部鱗片表皮角化，缺少顆粒層形成的過程，模擬銀屑病表皮分化不全的特點；利用動情期小鼠陰道上皮細(xì)胞增生活躍的特點，模擬銀屑病表皮增生過快的特點。咪喹莫特是Toll樣受體激動劑，主要通過活化先天性免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子來增強(qiáng)細(xì)胞免疫，刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答［8］。本研究參照文獻(xiàn)［4］，將咪喹莫特外用于小鼠皮膚構(gòu)建銀屑病樣皮損變化。藥效學(xué)研究表明，新芩梅顆粒能夠顯著促進(jìn)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層的形成，明顯抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂，減輕銀屑病樣皮損紅斑癥狀，并可以抑制皮損部位炎癥因子NO和MDA的生成。上述藥效學(xué)的具體作用機(jī)制，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。本研究對苓梅顆粒的提取和制劑工藝進(jìn)行了改進(jìn)，采用一步制粒工藝制備得到新芩梅顆粒，使給藥劑量由原來的20g／次降低到4g／次，且用蛋白糖替代原處方中的糖粉和糊精作為矯味劑，避免了原處方中糖分含量過大的缺點，擴(kuò)大了該制劑的應(yīng)用范圍。

［1］楊帝順，虞慧華，劉繼勇.正交試驗法優(yōu)選芩梅顆粒的提取工藝［J］.中成藥，2013，35（11）：2538－2540.Yang DiShun，Yu HuiHua，Liu JiYong.Optimization of the extraction technology of Qinmei granules by orthogonal test［J］.Chin Tradit Patent Med，2013，35（11）：2538－2540.In Chinese.

［2］王 萍，聶繼紅，孫玉華.雙黃解毒乳膏對銀屑病動物模型作用的實驗研究［J］.中成藥，2011，33（7）：1227－1229.Wang Ping，Nie JiHong，Sun YuHua.Experimental study on effects of Shuanghuangjiedu cream on the animal model of psoriasis［J］.Chin Tradit Patent Med，2011，33（7）：1227－1229.In Chinese.

［3］劉 靖，儲開宇，查旭山.銀屑1號對銀屑病樣動物模型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用［J］.新中醫(yī)，2011，43（4）：110－112.Liu Jing，Chu KaiYu，Zha XuShan.Effect of Chinese medicineNo.1prescription for psoriasis on the cytokine network in the animal model of psoriasis［J］.J New Chin Med，2011，43（4）：110－112.In Chinese.

［4］van der Fits L，Mourits S，Voerman J S A，etal.Imiquimod－induced psoriasis－like skin inflammation in mice is mediatedviathe IL－23／IL－17axis［J］.J Immunol，2009，182（9）：5836－5845.

［5］楊雪琴.銀屑病的合理治療（上）［J］.中國臨床醫(yī)生，2011，39（3）：34－38.Yang XueQin.Rational treatment of psoriasis（part one）［J］.Chin J Clin，2011，39（3）：34－38.In Chinese.

［6］鄭志忠.銀屑病的治療［J］.皮膚病與性病，2010，32（3）：8－9.Zheng ZhiZhong.The treatment of psoriasis［J］.J Dermatol Venereol，2010，32（3）：8－9.In Chinese.

［7］李 紅，周瀾華.銀屑病的生物治療新進(jìn)展［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24（9）：862－864.Li Hong，Zhou LanHua.The progress of biologic therapies in the treatment of psoriasis［J］.Chin J Dermatovenereol，2010，24（9）：862－864.In Chinese with English abstract.

［8］Valins W，Amini S，Berman B.The expression of Toll－like receptors in dermatological diseases and the therapeutic effect of current and newer topical Toll－like receptor modulator［J］.J Clin Aesthet Dermatol，2010，3（9）：20－29.