膠原蛋白海綿浸提液對(duì)小鼠體外脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的研究

【作 者】吳世福，劉成虎，侯麗，孫曉霞，蓋瀟瀟，施燕平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南市，250101

近年來(lái)，隨著人們對(duì)醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)安全性認(rèn)識(shí)的不斷深入，針對(duì)醫(yī)療器械，特別是動(dòng)物源性醫(yī)療器械和組織工程產(chǎn)品中免疫原的評(píng)價(jià)逐漸成為醫(yī)療器械產(chǎn)品開發(fā)和安全性評(píng)價(jià)的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。眾所周知，有效控制醫(yī)療器械中含有的免疫原是控制相關(guān)產(chǎn)品潛在免疫毒性反應(yīng)的關(guān)鍵所在。一般來(lái)說(shuō)，機(jī)體對(duì)醫(yī)療器械中免疫原的反應(yīng)大體可以分為體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩大類。其中，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是反映免疫原誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要方法。其原理為當(dāng)淋巴細(xì)胞在受到免疫原刺激時(shí)，可發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并發(fā)生轉(zhuǎn)化和增殖，通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖能力的強(qiáng)弱即可判定免疫原刺激能力的大小。

目前，實(shí)驗(yàn)室中常用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖的方法主要有3H-TdR摻入法和MTT法[1-2]。3H-TdR摻入法雖然敏感性較高，但需要實(shí)驗(yàn)室具有使用放射性材料的資質(zhì)并且操作人員需取得相應(yīng)的操作合格證書。因此，難以在大范圍內(nèi)推廣。相比較而言，MTT法雖然具有操作簡(jiǎn)便、快捷和安全等優(yōu)點(diǎn)，但卻難以排除不同群體淋巴細(xì)胞之間存在的干擾因素，因此在適用范圍上也受到了一定的限制。羧基熒光素乙酰乙酸（CFSE）是近年來(lái)使用較為普遍的一種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖的熒光染色標(biāo)志物[3-4]。它可以穿透活細(xì)胞膜并不可逆地與活體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，其熒光強(qiáng)度也變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半。因此，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各個(gè)連續(xù)細(xì)胞代的熒光強(qiáng)度呈2倍遞減。將CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出特定亞群淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖情況。與MTT法相比，CFSE標(biāo)記法不但具有準(zhǔn)確、快捷等優(yōu)點(diǎn)，還與MTT法之存在良好的關(guān)聯(lián)性。

膠原蛋白海綿是近年來(lái)開發(fā)上市的一種新型動(dòng)物源性功能敷料。該產(chǎn)品的膠原成分一般取自牛跟腱，經(jīng)不同加工工藝處理制得膠原蛋白海綿，主要用于創(chuàng)面止血和創(chuàng)傷修復(fù)，為可降解植入類醫(yī)療器械產(chǎn)品，并且具有良好的生物相容性。但是作為動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品，其在加工處理過(guò)程中無(wú)法徹底消除免疫原性。因此，選用合適的免疫原性評(píng)價(jià)方法對(duì)該類產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，將會(huì)有助于消除其潛在的免疫毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)ISO10993-20[5]中推薦采用的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)醫(yī)療器械對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能的方法，本研究分別在體外利用MTT法和CFSE法研究膠原蛋白海綿浸提液對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖作用的影響，旨在評(píng)價(jià)膠原蛋白海綿的免疫原性并探索建立一套體外評(píng)價(jià)醫(yī)療器械免疫原性的優(yōu)化方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

雌性BALB/c小鼠，(6～8)周齡，(18～22)g，購(gòu)自山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；L929細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑和器具

所以試劑 刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)和脂多糖(LPS)(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；CFSE(Invitrogen公司)；PE-CD3抗體(eBioscience，USA)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)。所用器具 倒置顯微鏡(Olympus TH4-200)；快速細(xì)胞分析儀(CASY-TT，德國(guó)innovatis AG)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan MK3)；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson,USA）。

1.3 試驗(yàn)樣品及處理

膠原蛋白海綿由合作單位提供。細(xì)胞毒性試驗(yàn)中陰性對(duì)照產(chǎn)品高密度聚乙烯和陽(yáng)性對(duì)照SPUZDEC均購(gòu)自日本Hatano研究所。按照ISO10993-12的原則[6]，取30 cm2無(wú)菌膠原蛋白海綿樣品，以RPMI1640完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，測(cè)定“吸收容量”后，按照6 cm2/mL的比例，在37±1oC的條件下浸提72±2 h，制備浸提液備用。

1.4 細(xì)胞毒性篩選試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照分別選取MEM完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按照0.1g/mL的比例，在37±1oC的條件下浸提24±2 h，制備浸提液，按ISO10993-5[7]中要求，對(duì)SPU-ZDEC、高密度聚乙烯和膠原蛋白海綿產(chǎn)品的浸提液進(jìn)行體外細(xì)胞毒性篩選試驗(yàn)。

1.5 淋巴細(xì)胞制備

脫頸椎處死3只BALB/c小鼠，無(wú)菌取脾，研磨制備單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液，混合后 400 g離心5 min，棄上清，加5 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，4oC孵育5 min，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)，400 g離心5 min，棄上清，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 2×106U/mL。

1.6 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)共分為以下幾組：

(1)陰性對(duì)照組（細(xì)胞對(duì)照，VC）；

(2)陽(yáng)性對(duì)照組1（細(xì)胞+ ConA，5 μg/mL）；

(3)陽(yáng)性對(duì)照組2（細(xì)胞+ LPS，10 μg/mL）；

(4)試驗(yàn)組1：細(xì)胞+第一種濃度抗原(浸提液原液)；

(5)試驗(yàn)組2：細(xì)胞+第二種濃度抗原（浸提液原液50%稀釋）。

1.7 試驗(yàn)步驟

1.7.1 MTT試驗(yàn)

將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔200 μL，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。陽(yáng)性對(duì)照組1加入ConA至終濃度為5 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組2加入LPS至終濃度為10 μg/mL，試驗(yàn)平板在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后取出，600 g離心5 min，棄上清，加入MTT（1 mg/mL），50 μL /孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，加入DMSO，150 μL/孔，振蕩平板至甲臜顆粒完全溶解，在酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD），參照波長(zhǎng)為630 nm。

1.7.2 CFSE試驗(yàn)

無(wú)菌制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液，用PBS至少洗2次，用2 mL含0.1%BSA的PBS重懸細(xì)胞，分別加入CFSE，終濃度為5 μMol/L。37oC避光孵育15 min～30 min。加入3 mL預(yù)冷的含2%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液終止染色反應(yīng)，冰上放置5 min后400 g離心5 min，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液2 mL。按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞懸液加入24孔板，1 mL/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。試驗(yàn)平板在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，收集各孔細(xì)胞，用PE標(biāo)記的抗小鼠CD3單克隆抗體在4oC避光條件下孵育30 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.8.1 MTT試驗(yàn)

記錄各組吸光度A的平均值。應(yīng)用t-檢驗(yàn)法來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果。與陰性對(duì)照組相比，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8.2 CFSE試驗(yàn)

記錄各組淋巴細(xì)胞的增殖百分比。應(yīng)用t-檢驗(yàn)法來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果。與陰性對(duì)照組相比，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性篩選試驗(yàn)結(jié)果

按ISO10993-5:2009的要求采用浸提液接觸法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖旺盛，形態(tài)良好。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞在48 h內(nèi)100%細(xì)胞發(fā)生圓縮死亡。各試驗(yàn)樣品組細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖旺盛，形態(tài)良好。正常細(xì)胞數(shù)量不少于空白對(duì)照組的80%。因此，定性判定試驗(yàn)樣品浸提液對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性為I級(jí)，表明該產(chǎn)品的浸提液無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用。

2.2 MTT法檢測(cè)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果

在細(xì)胞毒性篩選的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)分組利用MTT法進(jìn)行體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組吸光度A顯著增加（P<0.05），而試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間吸光度A值無(wú)明顯差異（P>0.05），表明膠原蛋白海綿產(chǎn)品浸提液不能在體外引起小鼠脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯的增殖和轉(zhuǎn)化（見圖1）。

圖1 MTT法測(cè)定小鼠體外脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（*P<0.05）Fig.1 Results of mouse splenic lymphocyte transformation assay with MTT method in vitro (*P<0.05)

2.3 CFSE法檢測(cè)體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的結(jié)果

在MTT試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，我們進(jìn)一步選用CFSE熒光摻入和PE-CD3抗體標(biāo)記染色法分析試驗(yàn)樣品對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的影響。流式結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，出現(xiàn)了多個(gè)增殖峰，增殖百分率從（6.01±0.9）%增加到（14.7±0.1）%，見圖2(a)和圖2(b)，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

圖2 CFSE法測(cè)定小鼠體外脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（*P<0.05）Fig.2 Results of mouse splenic T lymphocyte transformation assay with CFSE method in vitro (*P<0.05)

多年來(lái)，免疫應(yīng)答的特性一直是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。然而，關(guān)于醫(yī)療器械/材料免疫原性的研究卻很少。并且，目前還不清楚醫(yī)療器械/材料刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對(duì)宿主有利還是有害。因此，應(yīng)用醫(yī)療器械/材料或其浸提物進(jìn)行免疫應(yīng)答研究來(lái)獲取相關(guān)的信息是非常重要的，特別是針對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械，由于缺少評(píng)價(jià)免疫原性的技術(shù)和方法，很多該類產(chǎn)品在沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分安全性評(píng)價(jià)的情況下上市，為臨床應(yīng)用和患者的健康留下了隱患。因此，亟需在傳統(tǒng)組織學(xué)評(píng)價(jià)方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)出新的安全性評(píng)價(jià)方法來(lái)評(píng)價(jià)該類器械潛在的免疫毒理學(xué)作用以及對(duì)臨床使用后組織重建的長(zhǎng)期影響。淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力是衡量機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，針對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力的研究將有助于揭示醫(yī)療器械作用于人體后潛在的免疫毒理學(xué)反應(yīng)。

在本研究中，我們首先對(duì)所選取的動(dòng)物源性膠原蛋白海綿浸提液進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性研究，定性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，該產(chǎn)品浸提液無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用。這為進(jìn)一步使用MTT和CFSE標(biāo)記進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化研究提供了前提條件。在MTT試驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度值均小于陽(yáng)性對(duì)照組，提示試驗(yàn)組細(xì)胞增殖程度小于陽(yáng)性對(duì)照組，但各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異（見圖1）。在CFSE熒光標(biāo)記法中，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生明顯多峰增殖現(xiàn)象，而與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組細(xì)胞中CD3+T淋巴細(xì)胞未發(fā)生明顯增殖（見圖2），這表明，MTT法與CFSE法之間存在良好的關(guān)聯(lián)性。但是，與MTT法只能分析全部細(xì)胞增殖情況不同，結(jié)合熒光抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)，CFSE法可以便捷、高效地分析出小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞群體的增殖情況。例如，MTT法無(wú)法區(qū)分這一群細(xì)胞總體分裂一次與這群細(xì)胞中1/2的細(xì)胞分裂兩次測(cè)得的結(jié)果，而CFSE法則可以清晰追蹤特定細(xì)胞群體的整個(gè)分裂增殖過(guò)程。這里需要注意的是，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，初步考慮為試驗(yàn)樣品浸提液的處理促進(jìn)了CFSE與淋巴細(xì)胞之間的結(jié)合，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

影響本研究的關(guān)鍵因素包括ConA和LPS的濃度、試驗(yàn)周期的長(zhǎng)短和CFSE的標(biāo)記條件以及細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)中，我們選用的ConA終濃度為5 μg/mL，這是在參考文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上給出的濃度[8]。結(jié)果顯示，5 μg/mL 的ConA能夠較好地保證試驗(yàn)系統(tǒng)的正常工作，同時(shí)也可用于比較T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原和免疫原的免疫應(yīng)答。而LPS的濃度則是依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的。試驗(yàn)周期的選擇是影響本研究的另一重要因素。針對(duì)淋巴細(xì)胞對(duì)生物材料中免疫原的應(yīng)答，ASTM F1906標(biāo)準(zhǔn)[9]中推薦的試驗(yàn)周期為7 d，我們先后選用3 d、5 d和7 d的培養(yǎng)體系，綜合考慮細(xì)胞增殖高峰期和熒光淬滅等多種因素的影響，最終確定采用3 d的培養(yǎng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。但是具體到不同的試驗(yàn)樣品，建議實(shí)驗(yàn)者根據(jù)試驗(yàn)樣品的特性、文獻(xiàn)報(bào)道以及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定具體的試驗(yàn)周期。CFSE的標(biāo)記條件也是在參考文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上給出的[10]。結(jié)果顯示，在選用終濃度為5 μMol/L的 CFSE時(shí)，37oC避光孵育15 min～30 min的標(biāo)記時(shí)間符合該試驗(yàn)的要求。需要注意的是，不同CFSE試劑盒中會(huì)有不同的標(biāo)記濃度和標(biāo)記時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)摸索具體的標(biāo)記條件。本研究采用德國(guó)CASY-TT自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，將脾淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)到2×106U/mL，計(jì)數(shù)結(jié)果比手工計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確，有效保證了試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性。

另外，試驗(yàn)中需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)則。一般不建議在試驗(yàn)培養(yǎng)液中使用除青霉素/鏈霉素或慶大霉素以外的抗生素，因?yàn)樗鼈兊淖饔梅绞接锌赡芨蓴_到細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究通過(guò)CFSE熒光標(biāo)記術(shù)來(lái)研究動(dòng)物源醫(yī)療器械對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖作用的影響，并將其與傳統(tǒng)的MTT法進(jìn)行比較，為CFSE法在醫(yī)療器械免疫原性檢測(cè)中的運(yùn)用奠定了基礎(chǔ)。

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